2 resultados para Gastroenterite

em Universidade Catolica de Brasilia


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As doenças diarreicas estão entre as principais causadoras de morbidade e mortalidade pelo mundo. Os sapovírus têm sido descrito como uma causa comum de epidemias gastroentestinais, porém, há falta de informação sobre a prevalência desses vírus nos países em desenvolvimento, uma vez que não existe um método que possibilite a detecção em rotina laboratorial. Este trabalho tem por finalidade produzir anticorpos policlonais contra sapovírus, para o desenvolvimento de estratégias de detecção, tornando-se uma ferramenta útil na rotina laboratorial, além de permitir uma melhor compreensão epidemiológica, visto que, no Brasil há escassez de relatos da circulação do sapovírus. A partir de um sapovírus isolado no Distrito Federal foi realizada clonagem molecular utilizando a região do gene P2 de capsídeo no vetor pENTR 2B em células de E. coli cepa DH5-α, seguida de subclonagem no vetor pDEST 17 em E. coli cepa DH5-α, expressão da proteína em E. coli cepa BL21 AI, purificação da proteína utilizando uma coluna de Ni-NTA que possui a afinidade a proteína contendo His-Tag e inoculação em ratos. A proteína expressa possuía tamanho de 22kDa e foi confirmada através de Western Blotting utilizando anticorpo contra a região His-Tag. A obtenção e inoculação dessa proteína foi um grande avanço para a produção de anticorpos. Esses anticorpos serão úteis para o desenvolvimento de um kit diagnóstico baseado em ELISA.

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Há evidências que 2,5 milhões de crianças (≤5 anos) morram anualmente no mundo e que 200.000 nos Estados Unidos sejam hospitalizadas devido à Gastroenterite Aguda. O gênero Norovirus da família Caliciviridae é hoje reconhecido como a causa mais comum de surtos epidêmicos da doença. No entanto, ainda não foi possível o isolamento do vírus em cultura celular. Devido à semelhança molecular entre o vírus humano e o murino, a padronização da detecção e do isolamento de murino norovírus (MNV) torna-se necessária para que modelos experimentais de norovírus humano sejam criados com o objetivo de gerar mecanismos de prevenção, controle e tratamento das noroviroses. Foram coletadas 22 amostras fecais de camundongos provenientes de um biotério de Brasília e outras 5 amostras positivas anteriormente para presença de MNV foram cedidas. Para triagem de MNV foi realizada RT-PCR em todas as amostras suspendidas a 20% em PBS. Em placas com células RAW 264.7 foram inoculados 150 μL de suspensões fecais, diluídas em série, para avaliação de efeito citopático, sendo realizadas de cada amostra três passagens em cultura celular. A RT-PCR dos produtos de cultura viral de cada passagem foi realizada. Os métodos para clonagem e sequenciamento de cerca de 2,4 kb da extremidade 3’ de MNV de uma amostra fecal foram procedidos. Das 22 suspensões fecais testadas por RT-PCR, 2 foram positivas para MNV. Na cultura celular duas amostras foram positivas por RT-PCR, no entanto, apenas em uma foi observado efeito citopático (PR+Ob), a qual foi submetida à clonagem e sequenciamento de dois fragmentos das extremidades (sense e anti-sense). A análise filogenética dos fragmentos sugere maior proximidade com MNV 2. A percepção de efeito citopático em apenas uma amostra e a detecção da mesma em passagens limitadas sugere perda da integralidade da partícula viral necessária à infecção e subjetividade analítica.