Desenvolvimento de um protocolo para microinjeção em insetos utilizando Drosophila Melanogaster como organismo modelo


Autoria(s): Eisenhardt, Érika Garcia
Contribuinte(s)

Andrés Delgado Cañedo

Data(s)

25/01/2017

25/01/2017

02/12/2016

Resumo

Drosophila melanogaster é uma das espécies mais utilizadas em experiências genéticas, sendo de extrema importância para a biologia. Ao longo dos últimos anos houve um aumento do uso de ferramentas moleculares que auxiliam nos estudos que envolvem análises biológicas. Vários estudos revolucionários com diferentes organismos modelos vem sendo realizados, desde sequenciamento completo de genomas até a produção de organismos transgênicos utilizando, por exemplo, elementos transponíveis. Elementos transponíveis, conhecidos como DNA móvel, são sequências de DNA que se movem de um local para outro no genoma. Um dos sistemas mais utilizados nos últimos anos, é o transposon piggyBac, que apresenta uma ampla gama de hospedeiros, que vão desde os insetos até o uso em mamíferos. A técnica mais utilizada para produzir insetos geneticamente modificados é a microinjeção, que consiste na entrega do DNA exógeno diretamente no núcleo da célula que se pretende transformar. Sabendo disso, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de microinjeção de baixo custo para a criação e desenvolvimento de insetos transgênicos utilizando D. melanogaster como organismo modelo. O plasmídeo utilizado para estabelecer o protocolo de microinjeção foi o pBac[3xp3-EGFPattB]. As agulhas utilizadas na microinjeção foram feitas utilizando quatro tipos de configurações do aparelho PC-10. Para obter ovos de D. melanogaster, transferimos as moscas para meios de oviposição e duas receitas foram testadas. Para realizar a decorionação, dois métodos foram testados: No primeiro método, foi utilizado uma solução de CaCl2 a 1% em água destilada. No segundo método, os ovos foram banhados em água destilada e álcool etílico 92,8º. Após estes processos, 10 ovos foram fixados em cada lâmina de microscópio com fita dupla-face transparente e cobertos com óleo mineral. Em cada ovo foi injetado 1 μL do plasmídeo pBac[3xp3-EGFPattB] com concentração de 181 ηg/μL. 40 ovos foram injetados, 2 se desenvolveram e atingiram a fase adulta. Os melhores resultados foram obtidos utilizando agulhas com diâmetro em torno de 45 μm. Os dois meios de oviposição foram eficientes. Na decorionação, a água destilada mais o álcool 92,8º apresentou melhor remoção do córion, e o óleo mineral Naturol foi eficaz contra a dessecação. Não foi possível a análise da expressão do plasmídeo, pois o constructo não possuía o gene da transposase, o que impediu a estabilidade do DNA exógeno no genoma. Nossos objetivos principais foram alcançados, um protocolo de baixo custo de consumíveis foi desenvolvido. Porém, mais testes são necessários utilizando um conjunto de plasmídeos que permita a observação da integração do DNA exógeno no genoma.

Drosophila melanogaster is one of the most used species in genetic experiments, being of extreme importance for biology. Over the last few years there has been an increase in the use of molecular tools that aid the development of biological studies. Several revolutionary studies with different model organisms have been carried out, from complete genome sequencing to the production of transgenic organisms using, for example, transposable elements. Transposable elements, also known as mobile DNA, are DNA sequences that move from one place to another in the genome. One of the most widely used systems in recent years is the transposon piggyBac, which features a wide range of hosts, ranging from insects to mammalian use. The technique most used to produce genetically modified insects is microinjection, which consists in the delivery of exogenous DNA directly into the nucleus of the target cell. Taking this in account, the objective of this work was to establish a microinjection protocol for the creation and development of transgenic insects using D. melanogaster as a model organism. The plasmid used to establish the microinjection protocol was the pBac[3xp3-EGFPattB]. The needles used in microinjection were made using four types of PC-10 configurations. To obtain eggs of D. melanogaster, we transferred the flies to oviposition media and two recipes were tested. In order to perform the dechorionation, two methods were tested: The first method was performed by using, 1% CaCl2 solution in distilled water was used. The second method, the eggs were bathed in distilled water and ethyl alcohol 92,8°. After these processes, 10 eggs were fixed on each microscope slide with transparent double-sided tape and covered with mineral oil. In each egg was injected 1 μL of pBac [3xp3-EGFPattB] plasmid (181 ηg/μL). 40 eggs were injected, 2 were developed and reached adulthood. The best results were obtained using needles with a diameter ranging from 45 μm. The two oviposition media were efficient. In the dechorionated, distilled water plus 92,8° alcohol presented better removal of the chorion, and naturol mineral oil was effective against desiccation. It was not possible to analyze the expression of the plasmid because the construct did not possess the transposase gene, which able the stability of exogenous DNA in the genome. Thus, our main objectives were achieved, establishing a low cost of consumables microinjection protocol. However, further testing will be required to aiming the expression of exogenous DNA into the model organism.

Identificador

http://hdl.handle.net/riu/773

Idioma(s)

pt_BR

Publicador

Universidade Federal do Pampa

Direitos

Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/

Palavras-Chave #Genes estruturais de insetos #Transgenes #Histologia #Structural Genes Of Insects #Histology #Transgenes
Tipo

Monograph