Detecção de micoplasmas hemotrópicos pelo método de reação em cadeia da polimerase em cães de Curitiba - Paraná - Brasil

Orientador : Prof. Dr. Antonio F. P. de F. Wouk

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa: Curitiba, 24/03/2009

Inclui referências ao final de cada capítulo

Área de concentração : Patologia veterinária

Resumo: Os micoplasmas hemotrópicos são bactérias gram negativas, em forma de cocos, anéis ou bacilos, que parasitam eritrócitos de uma grande variedade de mamíferos, entre eles os cães. A hemoplasmose nos cães é geralmente um achado laboratorial. Raramente cães sem comprometimento imunológico ou não esplenectomizados desenvolvem a infecção. Os sinais da doença incluem febre, anorexia, mucosas pálidas e a anemia, quando presente, é discreta a moderada. A hemoplasmose nos cães é causada pelas bactérias Mycoplasma haemocanis (Mhc) e "Candidatus Mycoplasma haematoparvum" (CMhp). A transmissão ocorre pelo repasto do carrapato Rhipicephalus sanguineus, transfusão sanguínea, transmissão vertical de cadela para filhotes foi reportada, porém não há certeza se é transmitido por via placentária ou no momento do parto. O diagnóstico é feito pela visualização do agente infeccioso sobre a membrana eritrocitária ao exame do esfregaço sanguíneo, sem identificação da espécie de micoplasma. O diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR) é considerado padrão ouro por ter maior sensibilidade e especificidade que a citologia. O PCR para hemoplasmas é feito com a amplificação dos genes 16SrRNA e rnpB. O sequenciamento destes genes permite a identificação entre as espécies de hemoplasmas caninos e felinos. Foram realizados testes em 99 amostras de sangue de cães provenientes de um laboratório comercial da cidade de Curitiba. Foi realizada a extração do DNA e PCR para os genes GAPDH, gene constitutivos que garantem a qualidade de extração, 16SrRNA para Mycoplasma haemofelis (Mhf) "Candidatus Mycoplasma haemominutum" (CMhm) e "Candidatus Mycoplasma turicensis" (CMtc). Das 94 amostras positivas para o GAPDH, 16 (17,02%) geraram amplicons para pelo menos uma das três espécies testadas, nenhuma amostra apresentou co-infecção com mais de uma espécie. Do total de amostras, 9/94 (9,57%) foram positivos para Mhc, 4/94 (4,26%) para CMhp e 3/94 (3,19%) para CMTC, num total de 16 amostras positivas. Destas, 13 pertenciam ao grupo de 64 anêmicos (20,31%) e as outras 3 ao grupo de 30 não anêmicos (10,0%), com o dobro de risco de animais anêmicos possuírem a infecção. Um total de 10/46 (21,74%) machos foram positivos e 6/48 (12,5%) fêmeas foram positivas para hemoplasmas, indicando maior probabilidade de machos serem positivos. Um total de 2/18 animais com até 12 meses (11,12%) foram positivos, e 14/76 com mais de 12 meses (18,42%) foram positivos, mostrando maiores chances de cães com mais de 12 meses serem positivos. Não houve diferença significativa entre as idades dos animais positivos e negativos, e entre os hematócritos dos cães anêmicos e cães não anêmicos. Porém houve diferença significativa entre a presença de hemoplasmas e anemia, indicando que os hemoplasmas podem causar anemia em cães. Relata-se pela primeira vez a presença de "Candidatus Mycoplasma turicensis" em cães em Curitiba, Brasil. Palavras-chave: Cão, micoplasmas hemotrópicos, PCR, anemia

Abstract: Hemotropic mycoplasmas are gram negative, coccoid, ring or rod shaped bacteria,which parasite erythrocytes of a wide variety of mammals, including dogs. Hemoplasmosis in dogs is often a laboratory finding. Dogs without immunological restrain or non-splenectomized rarely develop the infection. Signs of disease include fever, anorexia, pale mucous membranes and anemia, when present, is mild to moderate. Hemoplasmosis in dogs is caused by bacteria Mycoplasma haemocanis (Mhc) and "Candidatus Mycoplasma haematoparvum" (CMhp). Transmission occurs by Rhipicephalus sanguineus tick feeding, blood transfusion, vertical transmission from bitch to offspring has been reported, however transplacental or at birth transmission has not been elucidated yet. Diagnosis is made by visualization of infectious agent on the erythrocyte membrane over blood smear examination, with no species identification. Diagnosis of polymerase chain reaction (PCR) is considered the gold standard due to higher sensitivity and specificity than cytology. Hemoplasma PCR is performed by 16SrRNA and rnpB gene amplification. Sequencing of these genes may allow to species identification between canine and feline hemoplasmas. A total of 99 samples were tested in dogs from a commercial laboratory in Curitiba, Brazil. DNA extraction and PCR for GAPDH housekeeping gene, which insures quality control of extraction, 16SrRNA for Mycoplasma haemofelis (Mhf) "Candidatus Mycoplasma haemominutum" (CMhm) and "Candidatus Mycoplasma turicensis" (CMtc). Out of 94 positive samples for GAPDH, 16/94 (17.02%) produced amplicons of at least one of three tested species, and no sample presented co-infection with more than one species. A total of 9/94 (9.57%) were positive for Mhc, 4/94 (4.26%) for CMhp and 3/94 (3.19%) for CMtc. Out of 16 positive samples, 13 were from the 64 anemic group (20.31%) and other 3 were from the 30 non-anemic group (10.0%), showing a double likelihood of anemic dogs to have the infection. A total of 10/46 dogs (21.74%) were positive, and 6/48 (12.5%) were positive for hemoplasmas, showing higher chances of males to be positive. According to age, 2/18 animals younger than 12 months of age (11.12%) were positives and 14/76 older than 12 months (18.42%) were positive, showing higher chances of older dogs to be positive. No significant differences were found between ages and positive/negative animals, and between packed cell volume of anemic and non-anemic dogs. However a significant difference was found between presence of hemoplasma and anemia, showing that hemoplasmas may cause anemia in dogs. "Candidatus Mycoplasma turicensis" has been reported for the first time infecting dogs in Curitiba, Brazil. Palavras-chave: dog, hemotropic hemoplasma, PCR, anemia