Biochemical study of Polynucleotide Phosphorylase from the foodborne pathogen Campylobacter jejuni

As bactérias devem adaptar-se e responder rapidamente a diferentes condições ambientais. As ribonucleases são as enzimas responsáveis pela maturação e degradação de moléculas de RNA, permitindo uma rápida adaptação dos níveis de RNA a diferentes ambientes. Esta adaptação é crucial para as bactérias patogénicas invadirem e estabelecerem-se dentro do hospedeiro. A PNPase (Polynucleotide phosphorylase) é uma exoribonuclease homotrimérica com actividade 3’-5’ e que para além de degradar RNA, também é capaz de sintetizar caudas heteropoliméricas. Esta enzima tem sido implicada na virulência em muitos patogénicos humanos, nomeadamente em Salmonella, Dichelobacter nodosus, Dickeya dadantii, Yersinia e Campylobacter jejuni. C. jejuni é um importante patogénico humano de origem alimentar e é considerado como a principal causa de gastroenterite bacteriana em humanos em todo o mundo. No entanto, a informação sobre o metabolismo do RNA em C. jejuni é limitada. Sabe-se que a PNPase é essencial para a sobrevivência das células a baixa temperatura, afecta a síntese de proteínas envolvidas na virulência e tem um papel importante na motilidade, adesão das células/capacidade de invasão e colonização das aves. Para compreender como a PNPase está envolvida na virulência é necessário fazer uma análise bioquímica desta ribonuclease e ver como esta é influenciada por factores físicos e químicos. Neste trabalho caracterizámos a actividade bioquímica da PNPase de C. jejuni. Sobre-expressámos e purificámos a PNPase, os mutantes PNPase_ΔS1 e PNPase_ΔS1ΔKH de C. jejuni e testámos a sua actividade e capacidade de ligação utilizando substratos de RNA sintéticos. Demonstrámos que a actividade da PNPase é regulada em função da temperatura. Além disso, verificámos que as actividades degradativas e de polimerização são altamente reguladas na presença de certos metabolitos. Mostrámos também que os domínios KH e S1 da PNPase desempenham um papel importante na ligação do substrato e na formação de trímeros, com consequências para a actividade da proteína.