Diseño de un vector no viral basado en nanopartículas lipídicas para el tratamiento de la hepatitis C mediante ARN de interferencia

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La hepatitis C sigue siendo hoy en día un problema de salud pública a nivel mundial. Se estima que hay 170 millones de personas infectadas por el virus de la hepatitis C (HCV, del inglés hepatitis C virus) en el mundo, con 3-4 millones de nuevas infecciones cada año. Sólo una fracción de las personas infectadas responden al tratamiento estándar consistente en una triple terapia compuesta de interferón-¿ (INT-¿) o interferón-¿ pegilado (PEG-INT-¿), ribavirina e inhibidores de la proteasa (como telaprevir, boceprevir o los recientemente aprobados simeprevir o sofosbuvir). Sin embargo, el éxito del tratamiento depende del genotipo y la carga viral tanto al inicio de la infección como durante el tratamiento. Los efectos adversos, además, son frecuentes y graves. Muchos de los pacientes infectados que no responden a este tratamiento acaban desarrollando una infección crónica caracterizada por una inflamación del hígado que acaba en cirrosis hepática, hepatocarcinoma y finalmente en fallo hepático.La diversidad de genotipos en los cuales el tratamiento actual no es efectivo, junto con la aparición de resistencias debido a la presión farmacológica selectiva, complican aún más el tratamiento constituyendo esta resistencia al tratamiento antivírico un problema de gran transcendencia sociosanitaria. Existe, por lo tanto, una gran urgencia para desarrollar una estrategia antiviral alternativa a los tratamientos actuales.Una de las nuevas estrategias propuestas para el tratamiento de la hepatitis C es la terapia génica con ARN de interferencia (RNAi). El RNAi es un mecanismo biológico natural que se basa en la existencia de secuencias de ARN complementarias de manera muy específica con un ARN mensajero (ARNm), de modo que provocan la destrucción del producto diana o inhiben su síntesis. Desde su descubrimiento a finales del siglo XX, el RNAi ha duplicado su potencial como estrategia terapéutica frente a diferentes enfermedades entre las cuales se encuentran las enfermedades infeccionas.El HCV es un virus que contiene una sola cadena de ARN (+) con capacidad para replicarse en el citoplasma de las células que infecta, y por tanto el uso del RNAi puede ser una buena estrategia terapéutica capaz de inhibir su replicación. El genoma del virus se compone de secuencias codificantes (tanto de proteínas estructurales del núcleo o de la envoltura del virus, como de proteínas no estructurales), flanqueadas por dos secuencias no codificantes situadas en ambos lados (5¿UTR y la 3¿UTR). Se trata, además, de un virus con una marcada variabilidad genética y cuyo grado de variabilidad no es homogéneo a lo largo de todo su genoma; no todas las regiones tienen la misma capacidad de mutar. Las regiones más conservadas del genoma son las no codificantes, es decir, la 5¿UTR y la 3¿UTR y dentro de la región de lectura abierta (ORF, del inglés open reading frame) los genes más conservados son los que codifican para proteínas dela nucleocápside, NS3 y NS4, mientras que las zonas más heterogéneas son las que codifican para la envoltura (E1 y E2/NS1) y para las proteínas no estructurales (NS2, NS5). Por lo tanto, debido a las altas tasas de mutación de los virus en respuesta a la presión selectiva, las moléculas de RNAi deberán estar dirigidas a secuencias lo más conservadas posibles dentro del genoma viral.Otro aspecto a tener en cuenta es el tipo de moléculas de RNAi empleadas. Existe una vía fisiológica de silenciamiento que comienza cuando se expresa un pre-miRNA (micro-RNA precursor), una cadena sencilla que puede plegarse y formar una horquilla de doble cadena denominada miRNA. Otra posibilidad es introducir directamente dsRNAs (del inglés double-stranded RNA) sintéticos, o un plásmido que contenga una horquilla que exprese el dsRNA. En este segundo caso, se habla de expresión de shRNAs (siglas en inglés de short hairpin RNA). En ambos casos, estas cadenas dobles de ARN son cortadas por una enzima denominada Dicer en pequeños fragmentos (19 a 24 nt) de doble cadena denominados siRNAs (ARNs cortos de interferencia o short interfering RNAs). El bloqueo del ARNm se produce con una alta especificidad con la secuencia diana y es mediado por el complejo RISC (complejo silenciador inducido por ARN o RNA induced silencing complex).La principal ventaja de emplear shRNAs radica en un efecto de silenciamiento más prolongado en el tiempo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que para conseguir que la terapia basada en ácidos nucleicos sea efectiva es necesario asegurar que el material genético llegue a la célula diana, así como su protección frente a agentes del medio que podrían degradarlo. Por lo tanto, es preciso diseñar sistemas de administración adecuados para este fin. En este sentido, las nanopartículas sólidas lipídicas (SLNs) son una buena opción debido a su biocompatibilidad, seguridad y facilidad de producción. Otra ventaja importante es la posibilidad de incorporar en su superficie ligandos con el fin de lograr, entre otros, un incremento de la internalización celular o una distribución selectiva a tejidos y órganos concretos, lo que redunda en una mayor eficacia y/o menores efectos adversos.La protamina, por ejemplo, es un péptido capaz de condensar y proteger el ADN. Además, posee secuencias de localización nuclear (NLS, del inglés nuclear localization signals) con un alto contenido en arginina que favorecen la entrada del ADN desde el citoplasma hacia el núcleo celular a través del complejo de poro nuclear (NPC, del inglés nuclear pore complex). El dextrano y el ácido hialurónico son polisacáridos biocompatibles que se han usado para incrementar la capacidad de tranfección de las SLNs y que utilizan diferentes mecanismos de entrada celular. Se ha comprobado que el dextrano prolonga el tiempo de circulación de las SLNs in vivo dificultando su interacción con los componentes séricos. El ácido hialurónico por su parte, es un polímero hidrofílico, con carácter mucoadhesivo y que es capaz de prevenir la adsorción de saponinas por repulsión esteárica.Teniendo esto en cuenta, el objetivo principal de esta tesis es el diseño y evaluación de un vector no viral a base de nanopartículas sólidas lipídicas (SLN) para el tratamiento de la hepatitis C mediante terapia génica basada en RNAi. Las formulaciones se elaboraron utilizando el plásmido shRNA74, complementario a la secuencia IRES (Sitio Interno de entrada al Ribosoma o internal ribosome entry site) del genoma vírico situada en el extremo 5¿UTR, altamente conservada e imprescindible para la iniciación de la replicación del virus.En la primera parte del trabajo se evaluaron dos tipos de vectores compuestos por SLNs, protamina (P) y un polisacárido, dextrano (DX) o ácido hialurónico (HA), con diferente carga del plásmido. Para ello los vectores se formaron a dos proporciones shRNA74:SLN : 1:2 (HA-SLN2 o DX-SLN2) y 1:5 (HA-SLN5 o DX-SLN2).Los vectores se caracterizaron en términos de tamaño, carga superficial y capacidad de unión, liberación y protección del plásmido frente a DNasas. El tamaño de todos los complejos fue inferior a 240 nm de diámetro y la carga superficial en torno a +35 mV. Todos los vectores mostraron una buena capacidad de unión del material genético siendo capaces de protegerlo frente a DNasas y también de liberarlo.El hígado es el principal órgano diana de la infección crónica por HCV y aunque existe un reservorio extrahepático (células dendríticas y células B, entre otras), el virus se replica preferentemente en el citoplasma del hepatocito. Por lo tanto, el siguiente paso fue la evaluación de la eficacia de silenciamiento de los diferentes vectores en la línea celular de hepatocarcinoma humano HepG2. Para ello, se transfectaron las células con un transfectante comercial para que expresaran el HCV-IRES, que contiene la secuencia IRES del genoma del virus junto con la secuencia que codifica la proteína verde fluorescente (GFP).Se comparó la eficacia de silenciamiento de los vectores a diferentes dosis de plásmido, así como también la viabilidad celular. En cuanto a la eficacia de silenciamiento, las formulaciones elaboradas con HA resultaron ser más efectivas que las preparadas con DX. Con ambas formulaciones se observó que la eficacia de silenciamiento depende de la dosis de plásmido administrada. El mayor silenciamiento, 66%, se obtuvo con el vector HA-SLN5 a la mayor dosis de shRNA74 (3 ¿g), frente al 36% que se obtuvo con el vector DX-SLN5 a la misma dosis. La viabilidad celular, indicativa de una potencial toxicidad, también dependió de la dosis de shRNA74; con los vectores preparados con HA descendió desde un 90% con la menor dosis hasta un 65% con la dosis mayor (3 ¿g de shRNA74). El mismo comportamiento se observó con los vectores preparados con DX, aunque con menor descenso de los valores de viabilidad. Por lo tanto, es tremendamente importante llegar a un equilibrio entre eficacia de silenciamiento y viabilidad, ya que una de las premisas de la utilización de vectores no virales es no comprometer la viabilidad celular.Unos de los procesos que condicionan enormemente la capacidad de transfección de los vectores es la capacidad de penetrar en el interior de las células diana. Nuestros vectores fueron captados de manera rápida y efectiva, siendo la captación mayor cuanto mayor era la proporción shRNA74:SLN. Sin embargo, no se observaron diferencias en la captación dependiendo del polisacárido empleado en la preparación de los vectores. Por lo tanto, las diferencias en la eficacia de silenciamiento entre los vectores preparados con HA y los preparados con DX no parecen deberse a diferencias en la capacidad de entrar en las células, sino que podrían estar condicionadas, en parte, por la mayor capacidad de los vectores HA-SLN para proteger el ADN, y en parte por el mecanismo de internalización celular de las nanopartículas, que depende tanto de la línea celular como de la composición del vector. En general, las SLNs son internalizadas por mecanismos de endocitosis, y dependiendo de la línea celular y de la composición de los vectores, pueden utilizar la endocitosis mediada por clatrinas o mediada por caveolas. En las células HepG2 estos mecanismos están presentes y los vectores podrían utilizar estas dos vías. Sin embargo, el vector preparado con HA podría ser captado por las células tras la interacción con el receptor CD44 (presente en las células HepG2), ya que el HA es un sustrato de este receptor. El hecho de que el vector HA-SLN utilizara, al menos en parte, esta vía de entrada y el vector DX-SLN no, podría justificar también las diferencias en la eficacia de silenciamiento. Además, el HA es capaz de modular el alto grado de condensación del plásmido debido al efecto de la protamina, facilitando así la liberación del mismo.Por lo tanto, este estudio demuestra la capacidad de los vectores no virales compuestos por SLN, protamina y HA o DX, junto con el plásmido shRNA74 para silenciar la expresión de HCV-IRES en la línea celular HepG2, siendo más eficaces aquellos formulados con HA. En base a estos resultados, se seleccionó el vector SLN-HA para los estudios posteriores.En la segunda parte del diseño experimental de la tesis, con el fin de realizar una aproximación más real, se evaluó la eficacia de los vectores en la línea celular humana de hepatoma (Huh-7 NS3-3¿) que contiene un transcripto subgenómico de un replicón de HCV.Previamente se comprobó que la eficacia de silenciamiento en la línea celular Huh-7 transfectada con el IRES-GFP era similar a la obtenida en las células HepG2. Posteriormente se evaluó la eficacia de los vectores para inhibir de la replicación del replicón en las células Huh-7 NS3-3¿. Mediante qRT-PCR se cuantificó la reducción en la cantidad de ARN correspondiente al replicón subgenómico del virus. Se observó que la mayor reducción se obtiene con el vector HA-SLN5 y con la mayor dosis de shRNA74, dando lugar a una inhibición del 50% de la replicación viral. Estos resultados confirman la potencial utilidad de los vectores en el tratamiento de la infección crónica por el HCV.Dada la importancia que tiene la capacidad de entrada en las células, ya que condiciona la eficacia de los vectores, el siguiente paso consistió en evaluar en mayor profundidad los mecanismos de entrada y la disposición intracelular de los vectores en las células Huh-7.En primer lugar se comprobó la presencia en las células Huh-7 de los principales mecanismos de internalización celular utilizados por las nanopartículas lipídicas: macropinocitosis, endocitosis mediada por caveolas y clatrinas, y entrada mediante el receptor CD44. El bloqueo de la endocitosis, proceso dependiente de energía que tiene lugar a 37ºC, y uno de los principales mecanismos de entrada de los vectores no virales, produjo una disminución en la captación de los vectores y en el nivel de silenciamiento. El hecho de que el nivel de silenciamiento se redujera en mucho mayor grado que la reducción en la internalización celular indicaría que la endocitosis es un mecanismo muy efectivo para el proceso de transfección y silenciamiento. Entre los diferentes mecanismos de endocitosis, la entrada mediada por clatrinas resultó ser el mecanismo más utilizado por los vectores, en menor medida la endocitosis mediada por caveolas y prácticamente nula la entrada por macropinocitosis.Otros procesos no dependientes de energía pueden participar en la captación celular de los vectores. El bloqueo de la captación celular mediada por el receptor CD44, presente en las células Huh-7 y al que se une el HA, redujo la internalización de los vectores, pero no dio lugar a un descenso del silenciamiento. Esta vía de entrada por receptor, por lo tanto, parece ser menos efectiva que la entrada por endocitosis. El hecho de que al bloquear el receptor CD44 se inhiba la captación y no el silenciamiento puede ser debido a que al inhibir una vía de entrada se pueden estar activando otros mecanismos. Hay que tener en cuenta que dada la complejidad de los sistemas biológicos, pueden participar simultáneamente varios mecanismos de internalización y que el bloqueo de uno de ellos puede inducir los otros.También se estudió la disposición intracelular del material genético y cómo está condicionada por la composición del vector. Se comprobó a nivel intracelular el alto grado de condensación del shRNA74, debido en parte al lípido catiónico de la nanopartícula y a la protamina. También se observó la disminución de la condensación a lo largo del tiempo y su aproximación a la membrana nuclear.Finalmente, y teniendo en cuenta que el órgano diana en el tratamiento de la hepatitis C es el hígado y considerando una posible administración parenteral, se evaluó la capacidad de los vectores para producir cambios a nivel hematológico que pudieran ser indicativos de una potencial toxicidad. En concreto, evaluamos el efecto hemolítico y el efecto sobre la aglutinación de eritrocitos y no observamos ni hemaglutinación ni actividad hemolítica significativa, probablemente debido a la estabilización estérica del HA, que impide la unión con componentes sanguíneos, lo que hace factible la posibilidad de llevar a cabo estudios in vivo en animales modelo de la enfermedad.En conclusión, esta tesis ha demostrado la capacidad de los vectores no virales basados en SLNs, P y HA, como sistemas de administración del plásmido shRNA74, para inhibir in vitro la replicación del HCV. Los resultados aquí presentados sirven como prueba de concepto de la utilidad de los vectores basados en SLNs como una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la infección crónica por el HCV. Es evidente que son necesarios estudios en modelos animales de infección por HCV para confirmar in vivo el efecto antiviral.