Caracterização química e biológica de peptídeos com propriedades antiproliferativas isolados da secreção cutânea do anuro Hypsiboas raniceps (Cope, 1862)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016.

Atualmente, é crescente o número de micro-organismos resistentes aos antibióticos convencionais sendo imprescindível o desenvolvimento de novas alternativas que possam conter o aumento da resistência microbiana. Os peptídeos antimicrobianos surgem como uma alternativa interessante, pois atuam sobre a membrana plasmática, reduzindo a possibilidade de resistência. A secreção cutânea de anfíbios é uma fonte rica de peptídeos antimicrobianos e muitos destes também apresentam atividade antiproliferativa e citotóxica sobre células tumorais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a secreção cutânea de Hypsiboas raniceps quanto à presença de peptídeos com atividade antiproliferativa e citotóxica sobre bactérias e fungos patogênicos, bem como células de melanoma murino (B16F10). Foram identificados e purificados dois peptídeos inéditos, denominados Hr22 e Hr24, com potente atividade sobre bactérias, principalmente sobre patógenos Gram-positivos e também mostraram-se ativos sobre eritrócitos humanos, células de melanona (B16F10) e fibroblastos normais (NIH3T3). No caso dos efeitos sobre células de melanoma, observou-se que os peptídeos também foram tóxicos para as células normais testadas, entretanto o peptídeo Hr24 indicou uma provável seletividade em relação às células de câncer, com uma dose efetiva com cerca da metade do valor obtido para as células normais. O tratamento empregando-se a dose correspondente ao IC75 do peptídeo Hr22 reduziu o número de células viáveis e a maioria das células apresentaram membrana plasmática danificada. Ambos os peptídeos induziram uma maior exposição de fosfatidilserina (marcada com anexina V-FITC) e não apresentaram marcação somente com iodeto de propídio (PI) quando testados na dose correspondente ao IC50. Empregando-se a dose do IC75 do peptídeo Hr22, observou-se alterações no potencial de membrana mitocondrial, além da fragmentação de DNA e alterações no ciclo celular, sugerindo morte celular por apoptose. Mais estudos são necessários para a melhor compreensão de como agem estes peptídeos. A produção de análogos com modificações estruturais podem melhorar suas atividades e especificidades tanto para micro-organismos quanto para células de câncer. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Currently, the number of microorganisms resistant to conventional antibiotics is rising, thus the development of new alternatives that may hold back this increase in resistance is essential. The antimicrobial peptides emerged as an attractive alternative because they act on the plasma membrane, reducing the possibility of resistance. Amphibian skin secretion is a rich source of these peptides and many of them also have activity on tumor cells. The present study aimed to evaluate Hypsiboas raniceps skin secretion for the presence of peptides with antiproliferative and cytotoxic activity against pathogenic bacteria and fungi, as well as murine melanoma cells (B16F10). Two novel peptides were identified, named Hr22 and Hr24, with potent activity against bacteria, especially on Gram-positive pathogens, also showing activity on human red blood cells, melanoma cells (B1F10) and normal fibroblasts (NIH3T3). In respect to the effects on melanoma cells, the peptides were also toxic to normal cell lines tested, however the Hr24 peptide indicated a probable selectivity in relation to cancer cells, with an effective dose of about half of the value obtained for normal cells. Treatment employing the corresponding IC75 dose of the Hr22 peptide reduced the number of viable cells and most cells showed plasma membrane damaged. Both peptides induced a higher exposure of phosphatidylserine (anexin V-FITC labeled) and were not labeled only with propidium iodide (PI) when tested with the corresponding IC50. Employing the IC75 dose of the Hr22 peptide, alterations were observed in the mitochondrial membrane potential, as well as DNA fragmentation and alterations in the cell cycle, suggesting cell death by apoptosis. More studies are needed to better understand how these peptides act. The production of analogs with structural modifications can improve their activities and specificities for both micro-organisms and cancer cells.