Análise proteômica de células não fagocíticas na fase inicial da infecção por trypanosoma cruzi

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015.

A Doença de Chagas é considerada uma doença negligenciada, endêmica na América Latina. e com tratamento ainda ineficaz. Estima-se que existam atualmente entre 6 e 7 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi (agente causador da doença) em todo o mundo. Esforços têm sido feitos na busca da produção de medicamentos efetivos e seguros além da necessidade na produção de uma vacina, tendo em vista a dificuldade do diagnóstico. Durante a transmissão vetorial, mais comum em regiões endêmicas Triatomíneos liberam formas tripomastigotas na corrente sanguínea que logo após contato com vários tipos celulares, inicia um processo de interação e infecção celular. Essa fase inicial é fundamental para a continuidade do ciclo biológico do parasito e instalação da doença. Dada a importância dessa fase, e pouco conhecimento sobre a modulação da célula hospedeira, o presente estudo realizou uma análise da célula hospedeira após interação inicial, utilizando para isso uma abordagem proteômica. Para essa investigação foi realizada análise comparativa por LC-MS/MS do extrato proteico de células HeLa (não fagocíticas) controle com extrato proteico de células HeLa após uma hora em contato com formas tripomastigotas (forma infectiva). Nossos resultados mostraram alteração em proteínas já conhecidas como por exemplo, proteínas de ligação ao cálcio e ao citoesqueleto. Ao se observar de forma detalhada proteínas com diminuição na abundância, foram encontradas proteínas constituintes do fator de histocompatibilidade de classe 1 (MHC1), subunidades importantes na montagem e função catalítica do proteassoma. Foram encontradas proteínas até então não descritas na literatura como moduladas pelo T. cruzi. Uma delas foi o aumento da Rpn11, uma subunidade do proteassoma com função de desubiquitinase, e a diminuição da cullina associada a NEDD8, uma proteína envolvida na identificação e ubiquitinação de proteínas que devem ser degradas. O processo de interação do T. cruzi com células HeLa também propiciou a modulação de proteínas participantes de outros processos celulares, como metabolismo, ligação ao DNA e chaperonas. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Chagas disease is regarded as a neglected illness endemic from Latin Americ and, furthermore, available drugs have limited efficacy and high toxicity. It is estimated that 6 to 7 milion people worldwide are infected by Trypanosoma cruzi (the etiologic agent of the disease). Nonetheless, efforts toward more effective treatment have been made as well as a vaccine is being pursued. In the vectorial transmission of the parasite, the most common in endemic regions, triatominean bugs release trypomastigotes in the lood stream. The parasites through the contact with several host cell types initiate biochemical processes for cell interaction and infection. This early stage is Given its importance, and the limited information available regarding the modulation of the host cell, this study analyzed the T. cruzi infection effects in mammalian host cells at the early stages of the process through high-throughput proteomic approach. Therefore, a comparative quantitative proteome analysis by means of LCMS/ MS was carried out between Hela cells which were incubated or not with trypomastigote forms (the main infective life form) The resulting list of regulated proteins showed known proteins, e.g calcium and cytoskeleton binding proteins. Regarding proteins with decreased expression, there were Major Histocompatibility Complex I proteins and subunits of the proteasome machinery important to its assembly and catalytic functions. This also corroborates with recent studies demonstrating its relevance on escaping the immune system’s surveillance by jeopardizing the host cell antigen presentation. Also there were proteins related to the ubiquitination process. And among those with no expression modulation reported so far, here we observed an increase in Rpn11, a proteasome subunit with deubiquitinase function, and decrease in cullin associated to NEDD8, a protein involved recognition and ubiquitination of proteins to be degraded. The interaction process between T. cruzi and HeLa cells also caused the modulation of proteins involved in metabolism, DNA binding and chaperones. This work underlines the need for further studies on processes of ubiquitination , degradation and targeting of T. cruzi proteins to MHC1 by host cells , which may be used by the immune system for the elimination of the parasite.