Escherichia coli : host interactions in the pathogenesis of canine pyometra

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

Canine pyometra develops as a result of a complex interaction of etiological and physiopathological factors, such as the virulence and type of the bacteria and the individual host defence mechanisms. Since Escherichia coli is the most common bacterium isolated from uterus of bitches with pyometra, one main objective of this work was to characterize E. coli virulence potential, and to evaluate the role of its virulence factors (VF) and traits in the pathogenesis of canine pyometra (Chapters IV, V and VI). A second main objective was to evaluate the innate immune mechanisms within the uterus and their role in E. coli recognition (Chapters III and VI). Results indicate that: i) although no single VF genes or virulence traits were associated with E. coli pyometra isolates, these isolates were mainly from the highly virulent phylogenetic group B2, which are characterized by a high number of uropathogenic E. coli VF genes and pathogenicity-associated islands markers; ii) Toll-like receptors were involved in the activation of the inflammatory response associated with pyometra; iii) β-hemolytic E. coli infection was associated with the occurrence of metritis and with an higher uterine tissue damage; iv) α-hemolysin (HlyA) contributes to the virulence of β-hemolytic E. coli, by inducing endometrial epithelial and stromal damage and a compromised early uterine immune response. Overall, these findings provide new relevant insights into the role of the pathogen-specific modulation of host immunity, which may influence the severity of disease and its clinical outcomes. Also, HlyA is a promising target for a vaccine, with the objective to induce an immunity that can block the binding and action of this toxin.

RESUMO - Interacão hospedeiro-Escherichia coli na patogenia da piómetra na cadela - A piómetra é uma doença comum do trato genital de cadelas adultas, durante a fase de diestro. A piómetra desenvolve-se como resultado de uma complexa interação de fatores etiológicos e fisiopatológicos. Entre estes, incluem-se a influência hormonal no útero, alterações estruturais no endométrio - como a hiperplasia quística (HQE) -, o tipo de bactérias e o seu potencial de virulência, e os mecanismos de defesa do hospedeiro. O trabalho desenvolvido nesta tese baseou-se no estudo do potencial de virulência de Escherichia coli (E. coli) (Capítulos IV e V) e nos mecanismos de imunidade inata do útero (Capítulos III e VI). Tendo em conta a elevada prevalência de E. coli nos casos de piómetra (82-100% dos casos) e nas infeções do trato urinário (54 – 68%) e o facto de aquelas estirpes serem provenientes da flora fecal do animal e não de um clone específico disseminado entre animais, procedeu-se à comparação do potencial de virulência de E. coli, isolada de piómetra, de cistites e de fezes de cadela (Capítulo IV). Os resultados indicam que as estirpes de E. coli, que colonizam o útero, têm um elevado potencial de virulência, possuindo um grande número de genes que codificam para fatores de virulência (FV) e ilhas de patogenicidade (PAIs). No entanto, existem estirpes de E. coli isoladas de cistite e de origem fecal com as mesmas características, o que sugere que poderão induzir piómetra, em cadelas suscetíveis. De particular importância, foi a observação de que cerca de 50% das estirpes de E. coli isoladas de piómetra eram β- hemolíticas. A prevalência dos isolados pertencentes ao grupo filogenético B2 foi maior nos casos de piómetra (94%) do que nos casos de cistite (48%) ou do que nos de origem fecal (39%). No entanto, independentemente da origem dos isolados, o número médio de PAIs e de genes que codificam para FV foi maior nos isolados pertencentes ao grupo filogenético B2, comparativamente aos outros grupos filogenéticos. Verificou-se também que o reto poderá funcionar como um reservatório de estirpes potencialmente patogénicas dos grupos filogenéticos B2 e D. Esta observação tem especial importância pois sabe-se que as estirpes de E. coli uropatogénicas isoladas de cães e humanos são similares em relação ao seu serotipo, tipo clonal, grupo filogenético e perfil de virulência. Isto sugere que os cães podem servir como reservatórios de bactérias potencialmente virulentas que podem ser transmitidas ao homem. Na primeira semana pós-parto, E. coli é a bactéria mais frequentemente isolada do conteúdo uterino de vacas de leite que desenvolvem infeções uterinas puerperais. No entanto, a associação, entre o perfil de virulência de E. coli e o desenvolvimento de metrite puerperal ou clinica, é controverso e, em muitos dos casos, a infeção resolve-se espontaneamente. Na cadela, as piómetras por E. coli estão associadas, em 50% dos casos, à síndrome de resposta inflamatória sistémica, a qual é potencialmente letal na ausência de terapêutica adequada. Numa tentativa de relacionar o potencial de virulência de E. coli com as diferentes evoluções da metrite clinica na vaca e da piómetra na cadela, compararam-se características genómicas dos isolados de E. coli (Capítulo V). Os resultados mostram que as estirpes de E. coli isoladas de vacas com metrite clinica pertencem maioritariamente aos grupos filogenéticos B1 e A, são geneticamente distintas das estirpes de piómetra e apresentam um menor número de genes que codificam para fatores de virulência, sendo por isso consideradas estirpes de menor potencial de virulência. A resposta uterina à infeção é composta por mecanismos da imunidade inata e adaptativa. A resposta inata é desencadeada pelo reconhecimento de padrões moleculares associados aos agentes patogénicos, por recetores do tipo Toll (TLRs), induzindo uma reacção inflamatória. Os resultados apresentados no Capítulo III permitem concluir que o útero da cadela tem capacidade de reconhecer uma grande variedade de ligandos - através da activação dos TLRs - e desenvolver uma resposta inflamatória contra vários tipos de microorganismos. Verificouse, também, que a transcrição e expressão dos TLRs 2 e 4 encontram-se significativamente diminuídas no início de diestro, o que pode contribuir para a maior susceptibilidade do útero à infeção por E. coli, nesta fase. Os resultados apresentados no Capítulo VI demonstram que, nos casos de piómetra a resposta inflamatória, mediada pelos TLRs, foi caracterizada por uma reação inflamatória exuberante, demonstrada pelo influxo de células de reação inflamatória no útero e por um aumento na transcrição de genes que codificam para citocinas próinflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGFβ). Observação relevante foi que, nos casos de piómetra por E. coli β-hemolítica, há um aumento significativo da ...