Role of Ccbe1 during cardiac differentiation of mouse ESCs

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Das suas quatro cavidades à sua síncrona rede elétrica, o coração foi perfeitamente projetado para servir de interface entre cada órgão presente no corpo humano. Devido à sua complexidade, as doenças cardiovasculares englobam também um grande conjunto de manifestações clínicas incluindo miocardites, hipertensão arterial, defeitos congénitos cardíacos e doenças isquémicas. Muitas destas patologias traduzem-se geralmente na perda de tecido cardíaco funcional e por outro lado pela formação de tecido fibrótico não funcional. Similarmente ao que ocorre nos países desenvolvidos, em Portugal também as doenças cardiovasculares continuam a ser uma das maiores causas de morbidade e mortalidade. Devido à limitada capacidade regenerativa do coração e ao facto das terapias existentes para tratar doenças cardiovasculares serem ineficientes ou implicarem enormes riscos para o paciente, é urgente desenvolver novas terapias mais eficazes. Nesse sentido, o uso de células multi e pluripotentes tem contribuído na última década para um franco avanço nesta área. Muitos ensaios clínicos têm sido feitos, ou decorrem ainda, onde se avalia a capacidade regenerativa de células estaminais de diferentes origens na reposição dos tecidos cardíacos danificados. Além disto pensa-se que certos nichos de células progenitoras de cardiomiócitos residentes no coração adulto possam representar um mecanismo endógeno de regeneração. De modo a explorar este mecanismo tem-se recorrido a técnicas de isolamento destas células para transplante em doentes cardíacos. No entanto, até agora as melhorias evidenciadas por essas terapias celulares parecem estar associadas a efeitos parácrinos que as células transplantadas exercem sobre os tecidos envolventes, em detrimento da sua implantação no tecido danificado e consequente diferenciação em novo tecido cardíaco. Em paralelo às terapias celulares tem-se feito um esforço para desenvolver patches e scaffolds que possam complementar estas terapias por facilitar o homing de células transplantadas ao constituírem uma matriz onde estas células possam ser envolvidas e desempenhar a sua função. Outra alternativa ao uso de células estaminais para uso em terapias de regeneração cardíaca é o uso de células já diferenciadas com identidade semelhante à do tecido a ser substituído. No caso do miocárdio, será potencialmente interessante o uso de cardiomiócitos como fonte em transplantes para a regeneração do tecido danificado. Tal abordagem é especialmente interessante visto terem sido identificadas no coração populações de novos cardiomiócitos derivados de cardiomiócitos já existentes, que contribuem para o turnover normal do miocárdio. No entanto, para explorar este mecanismo é necessário criar e otimizar protocolos eticamente aceitáveis para experimentação humana de derivação em grande escala de cardiomiócitos a partir de células pluripotentes. Tal objetivo pode ser alcançado através do uso de fatores segregados que possam ser utilizados para estimular o potencial cardiogénico das células pluripotentes. A procura de genes envolvidos na cardiogénese têm-se tornado cada vez mais importante com o objetivo de identificar potenciais fatores que possam modular este processo biológico quer in vitro como in vivo. De facto, é possível modelar in vitro com grande rigor os estadios iniciais da cardiogénese através da diferenciação de células estaminais. Tal como ocorre in vivo, a especificação das linhagens cardiovasculares in vitro implica uma transição para populações de células progenitoras cardíacas com potencial de diferenciação cada vez mais restrito e específico. Começando num estado de pluripotência, durante a sua diferenciação estas especificam-se em mesoderme cardíaca e posteriormente em células de todas as outras linhagens cardíacas. Para monitorizar o seguimento deste processo biológico e para assegurar o correto comprometimento nas várias linhagens cardíacas recorre-se à expressão génica de marcadores genéticos específicos para cada linhagem esperada em cada ponto específico de tempo. Através desta monitorização é possível identificar células de mesoderme cardíaca pela expressão dos genes Mesp-1 e Isl-1 a dia 4 de diferenciação das células estaminais, e também diferentes populações de células progenitoras cardíacas pela expressão concomitante de genes como Isl-1 e Nkx2.5 em dias posteriores. Assim é possível estabelecer em laboratório um modelo fidedigno e manipulável para se estudar a cardiogénese. Num rastreio génico efetuado pelo nosso laboratório em células progenitoras cardíacas de galinha com expressão do marcador Nkx2.5, foram identificados genes não caracterizados, mas com um potencial envolvimento na cardiogénese. Um destes novos genes identificados foi o collagen and calcium binding EGF domains 1 ou Ccbe1. Na literatura, é possível hoje ver que em modelos animais knockout para este gene, um outro processo biológico é afetado i.e. a linfangiogénese. Estes animais apresentam uma total ausência de vasos linfáticos. Este fenótipo deve-se em parte ao papel já identificado que o CCBE1 tem na maturação do fator pro-linfangiogénico VEGF-C. Em humanos a síndrome de Hennekam (associado também a mutações em CCBE1), é caracterizada pela existência de uma rede linfática disfuncional fazendo com que estes apresentem um edema generalizado. Não obstante estes estudos, recentemente verificou-se em ratinho e galinha a expressão deste gene nas regiões embrionárias que dão origem ao coração, sugerindo assim também um potencial papel neste processo. De facto, trabalho efectuado no nosso laboratório veio a demonstrar que o silenciamento deste gene em galinha leva ao desenvolvimento de defeitos cardíacos incompatíveis com a vida, associados a uma redução da proliferação das células cardiacas. Também, em ratinhos knockout para este gene é possível identificar um miocárdio subdesenvolvido pelo estreitamento da camada compacta do miocárdio também associado a problemas na proliferação. Assim, no presente trabalho propusemo-nos a estudar mais detalhadamente o envolvimento deste gene nos estadios iniciais da cardiogénese. Como este gene codifica para uma proteína secretada, a verificar-se um importante papel na cardiogénese, a sua manipulação como um fator de crescimento torna-se de grande interesse visando a otimização de protocolos para derivação de cardiomiócitos. Para estudar os estadios iniciais da cardiogénese recorremos ao uso de uma linha de células estaminais duplamente transgénica que nos permite acompanhar o processo de diferenciação para linhagens cardíacas pois expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de Nkx2.5 e a proteína fluorescente dsRed sob um promotor específico de cardiogénese de Mef2c. Assim pode-se confirmar que é possível obter células progenitoras cardíacas in vitro correspondentes aos estadios iniciais do desenvolvimento do coração de ratinho. De seguida analisámos o padrão de expressão de Ccbe1 e verificou-se que coincide com o aparecimento da expressão dos marcadores genéticos cardíacos, mostrando que in vitro a sua expressão ocorre aquando da especificação das células para as linhagens cardíacas. Posteriormente gerámos duas linhas estáveis de células estaminais com silenciamento de Ccbe1 para avaliar o seu impacto na cardiogénese. Os resultados demonstram que ao diferenciar estas células em agregados 3D conhecidos como corpos embrióides (nome dado devido à sua semelhança física e funcional com um embrião nos estadios iniciais do desenvolvimento), estas células são incapazes de se especificar em mesoderme cardíaca pois apresentam a expressão de Mesp-1 e Isl-1 reduzida. Em paralelo com estes resultados, foi possível verificar que os corpos embrióides gerados a partir de células estaminais com silenciamento de Ccbe1 apresentam um tamanho muito reduzido. Este defeito é devido não a um aumento da morte celular mas sim a um défice na proliferação das células estaminais silenciadas. Estes defeitos na proliferação estão de acordo com outros estudos efetuados pela nossa equipa, em que fibroblastos embrionários derivados de ratinhos knockout apresentam grandes problemas na proliferação. Adicionalmente, em embriões de galinha foi verificado necessidade de Ccbe1 para a correta proliferação de células precursoras cardíacas para formar o tubo cardíaco. Em conjunto, estes resultados demonstram que CCBE1 tem um papel importante em proliferação. Tais resultados são corroborados por experiências onde foi feita a adição de CCBE1 recombinante ao meio de cultura e se observou a recuperação parcial dos corpos embrióides silenciados. Apesar das dificuldades em produzir quantidades elevadas desta proteína recombinante, os resultados indicam que CCBE1 foi capaz de aumentar a proliferação dos corpos embrióides silenciados. No entanto, as células demonstram-se incapazes de se especificar em mesoderme cardíaca, sugerindo que para além deste papel que Ccbe1 tem em proliferação, o seu papel na cardiogénese é independente deste mecanismo. Conclui-se assim que Ccbe1 é indispensável para a especificação das células em diferenciação em mesoderme cardíaca. Para vir a ser utilizado no futuro como fator de crescimento em células estaminais em diferenciação, para derivar grandes quantidades de células cardíacas, é necessário desenvolver ainda mais estudos que permitam ultrapassar as limitações associadas à sua produção e à sua bioatividade. Paralelamente a estes estudos, uma outra parte do meu trabalho incidiu numa colaboração com uma equipa de bioinformática, na qual nos propusemos a analisar o transcriptoma de diferentes tipos de células progenitoras cardíacas. O objetivo desta análise seria primariamente identificar através de sequenciação RNA novas isoformas de genes envolvidos na cardiogénese, e adicionalmente identificar novos genes não caracterizados com potencial impacto na cardiogénese. Para tal utilizámos a linha de células estaminais duplamente transgénica já referida, da qual isolámos diferentes populações de células progenitoras cardíacas em dias de diferenciação diferentes. Conseguimos analisar o dataset resultante utilizando algumas ferramentas bioinformáticas, que nos permitiu construir uma lista de genes potencialmente envolvidos em cardiogénese ainda não caracterizados. Deste trabalho resultam alguns genes que merecerão um estudo funcional mais detalhado visto estarem claramente expressos nas regiões embrionárias cardiogénicas.

The identification and use of new growth factors to stimulate the cardiogenic potential of pluripotent cells is a safe and alternative approach to develop cell therapies to address the limited regenerative capacity of the heart. Collagen and calcium binding EGF domains 1 (Ccbe1) was firstly identified in our laboratory, which encodes for a secreted protein with potential involvement in cardiogenesis. Knockout animal models for this gene and humans with mutations in CCBE1, have lymphangiogenic defects, resulting in the absence of lymphatic vessels. This is in part due to the known described role that CCBE1 has in the processing of the pro lymphangiogenic factor VEGF-C. However, Ccbe1 is also expressed in the embryonic cardiogenic regions of both mouse and chick and in fact, silencing this gene in chick embryos leads to the development of heart defects incompatible with life. Noteworthy, knockout mice show an underdeveloped myocardium. The objective of the present work is to perform a detailed study of the involvement of this gene in the early stages of cardiogenesis. The results demonstrate that silencing the expression of Ccbe1 or blocking CCBE1 in differentiating stem cells, impairs their specification towards cardiac mesodermal lineages. Additionally, we found that differentiating Ccbe1 KD ESCs have a reduced proliferation rate that leads to smaller EBs. In agreement with this result, when supplementing the differentiating Ccbe1 KD ESCs lines with recombinant CCBE1, we were able to partially rescue the size of the EBs, but the expression of the cardiac mesoderm markers remained downregulated. These data suggest that those defects are independent from each other, but are intimately related to the disruption of Ccbe1, placing CCBE1 as a direct regulator of cell proliferation and cardiac mesoderm specification during ESC differentiation.