Characterization of bone pathologies in the ins2+/akita mouse, a new model for diabetes insulindependent: contribution for a better understanding of the disease in humans

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

In the past 30 years developed and developing countries faced significant lifestyle changes that made the incidence of diabetes mellitus to reach pandemic proportion worldwide. This increase, seen in both types of the disease, made diabetes mellitus one of the leading causes of morbidity and mortality of our times. Bone is one t of several organs that are affected by diabetes mellitus, being morbidity caused by bone fractures highly correlated to diabetic bone. Alterations in the constituents of bone, microarchitecture changes and bone loss have been pointed as the main reasons for its fragility. This work aimed to contribute to identify the molecular players or the functional changes affecting bone and caused by diabetes mellitus. In chapter 2, using as animal model of type 1 diabetes mellitus the Ins2+/akita mouse, we identified bone growth retardation related to growth plate impairment. These changes were associated to reduced expression of Igf1 and increased expression of cartilage degradation enzymes like Adams-5. We also identified severe microarchitecture changes caused by reduced bone formation and resorption that could be explained by leptin deficiency and/or decreased insulin signaling. In chapter 3, we concluded that paricalcitol (vitamin D analog) and cinacalcet (calcimimetic), two drugs used for the treatment of secondary hyperthyroidism, have beneficial effects in fin regeneration and mineralization in a zebrafish model of diabetes. These results could be explained by the downregulation of pthr suggesting reduced signaling of parathyroid hormone, that is a potent activator of bone remodeling, and increased expression of runx2, indicating increased osteoblast differentiation. Increased expression of the two zebrafish insulin genes, insa and insb, could be observed, suggesting that both drugs promote an increase in insulin signaling. In chapter 4, we suggest that in humans, the insulin paralog gene, INS-IGF2, does not have a redundant function with the insulin gene, in contrast with what is seen in mice and probably in zebrafish. We could also conclude that extrapancreatic expression of insulin is present in human, mouse and zebrafish. In humans this expression results mainly from expression of the ancestral gene while in mice and zebrafish it is due to expression of the insulin paralogues.

Alterações significativas no estilo de vida nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, durante as ultimas décadas, fizeram com que a incidência da diabetes mellitus tenha tomado proporções semelhantes às de uma pandemia. Este aumento, observado em ambos os tipos da doença, fez com que diabetes mellitus se tenha tornado uma das principais causas de morbidade e mortalidade dos nossos tempos. O osso está entre os vários órgãos que são afetados pela diabetes mellitus, estando a morbidade causada por fraturas ósseas, altamente correlacionada com esta doença. Perda óssea, alterações nos constituintes e na microarquitetura do osso, têm sido apontadas como os principais causas para a fragilidade óssea destes pacientes. Neste trabalho propusemo-nos identificar intervenientes moleculares que estão envolvidos nas alterações ósseas despoletadas pela diabetes mellitus. No capítulo 2, usando como modelo animal de diabetes mellitus tipo 1 o ratinho Ins2+ /akita, procurámos identificar alterações histomorfométricas na estrutura do osso e cartilagem e identificar genes com a expressão alterada através de PCR em tempo real quantitativo. Pudemos observar diminuição no crescimento ósseo causado por uma redução no número de condrócitos proliferativos e aumento no número de condrócitos hipertróficos na placa de crescimento. Estas alterações foram acompanhadas por uma redução na expressão de fatores de crescimento como a Igf1 e aumento da expressão de enzimas responsáveis pela degradação da cartilagem como Adams-5. Igualmente, pudemos observar alterações profundas na microarquitetura do osso do ratinho Ins2 +/akita, que sugerem reduzida formação e reabsorção óssea. O facto de a diabetes mellitus tipo 1 estar associada a um estado de hipoleptinémia e hipoinsulinémia faz com que ambas as hormonas, leptina e insulina, sejam as principais candidatas a explicar as alterações observadas, visto que ambas desempenham um papel ativador da função dos osteoblastos e osteoclastos. No capítulo 3, tentamos perceber se a vitamina D, análogos da vitamina D e calcimiméticos, podem ter um papel benéfico na regeneração e mineralização óssea na diabetes mellitus tipo 1. Foi possível concluir que os medicamentos paricalcitol (análogo da vitamina D) e cinacalcet (calcimimético), usados para o tratamento do hipertiroidismo secundário, têm efeitos benéficos na regeneração e mineralização da barbatana caudal num modelo de diabetes mellitus tipo 1 de peixe-zebra. Estes resultados poderão ser explicados pela diminuição da expressão da pthr, que sugere uma redução da hormona paratiróide circulante, que é um activador da remodelação óssea, e um aumento da expressão de runx2, que sugere maior diferenciação dos osteoblastos, assim como um aumento da expressão de ambos os genes insa e insb da insulina no osso, sugerindo que estes medicamentos poderão por um lado aumentar a expressão extrapancreática no osso e por outro a expressão pancreática, aumentando assim a sua sinalização nas células alvo. No capítulo 4 concluímos que nos humanos, o gene parálogo da insulina, o INS-IGF2, não tem uma função redundante em contaste com o que foi observado nos ratinhos e, provavelmente, no peixe-zebra. Foi também possível concluir que a expressão extrapancreática da insulina ocorre em humanos, ratinho e peixe-zebra e que nos humanos este fenómeno é devido principalmente à expressão do gene ancestral, enquanto no ratinho e no peixe-zebra parece ser devido à expressão dos parálogos respectivos.