Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

A Engenharia de Tecidos é uma área interdisciplinar da Medicina Regenerativa que visa criar e desenvolver substitutos biológicos para reparar, manter ou melhorar a função de tecidos lesados, com base em princípios da engenharia conjugados às ciências da vida. A Engenharia de Tecidos tira partido das propriedades de estruturas tri-dimensionais (3D) que combinadas com células estaminais pretendem recriar um ambiente semelhante ao nativo de um tecido. Estas estruturas 3D (scaffolds) são produzidas com materiais de origem natural ou sintéticos, que idealmente terão as propriedades físicas, mecânicas e químicas para promoverem o melhor desempenho dessas células e portanto a regeneração dos tecidos. Na última decada as células estaminais mesenquimais foram amplamente utilizadas na Engenharia de Tecidos, pois têm o potencial de proliferarem e se manterem indiferenciadas com a capacidade de se auto-renovarem e/ou diferenciarem em diferentes tipos de células. Existem várias fontes de células estaminais com caracteristicas diferentes utilizadas em TE, em que as que apresentam maior impacto são as derivadas da medula espinal, do sangue e do tecido adiposo, entre outras localizadas em diferentes zonas do corpo humano. A combinação entre scaffolds e células estaminais mesenquimais apresentam algumas limitações tais como a indução de uma resposta inflamatória após transplante e o facto da grande maioria dos biomateriais utilizados não serem biofuncionais. A Engenharia de Cell sheets é a alternativa, pois utiliza a matriz extracelular depositada pelas células como scaffold natural para a regeneração de diferentes tecidos. O conceito de cell sheet foi introduzido por Teruo Okano e os seu colaboradores nos anos 90 no Japão. Estas cell sheets são produzidas em superficies revestidas com um polímero não iónico sensível à temperatura. Quando a temperatura é inferior a 32ºC a superficie fica hidrofílica, promovendo o destacamento das células em folha (cell sheets) sem recorrer ao uso do tradicional tratamento enzimático. Assim, esta tecnologia permite obter cell sheets com uma organização celular própria e coesiva, dado que as interações célula-celula e célula-matriz extracelular são mantidas. Em estudos anteriores no nosso laboratório foram produzidas cell sheets a partir das células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs). As cell sheets de hASCs quando transplantadas para feridas excisionais em pele de ratinho, induziram a formação de cristas epiteliais, normalmente apenas encontradas em pele humana, e a formação de um número significativo de folículos pilosos. Tendo em consideração estes resultados e antevendo as possibilidades de ter estas cell sheets disponiveis para uso imediato na clínica (off-the-shelf) a sua criopreservação seria vantajosa. Assim, o objectivo deste estudo foi definir um método de criopreservação que não só permita a preservação da viabilidade das hASCs mas também a integridade da matriz extracelular das cell sheets, que se sabe ser critico para garantir a sua funcionalidade, após transplantação. De modo a minimizar um potencial efeito adverso do processo de criopreservação, o método testado teve como base o método standard slow cooling rate, utilizado na criopreservação de células em suspensão. Foram então definidas duas condições de criopreservação, a condição standard, com 10% do crioprotector Dimethylsulfoxide (DMSO), e a condição exprimental, com 5% DMSO. Com o objectivo reduzir a toxicidade para as células criopreservadas. O efeito das condições de criopreservação na viabilidade celular foi analisado depois das cell sheets serem dissociadas, tendo sido demonstrado que ambas as condições de criopreservação não afectam de forma significativa a viabilidade celular. No entanto, verificou-se que a organização do citoesqueleto das células na cell sheet sofreu alterações depois da criopreservação em ambas as condições, verificando-se uma desorganização mais acentuada na condição standard. Verificou-se ainda que ambas as condições de criopreservação afetam a integridade da matriz extracelular das cell sheets, embora pareça que a condição standard afecte de um modo mais significativo. Mais ainda ambas as condições de criopreservação afectaram a quantidade total de proteínas. Potencialmente, este resultado está associado com as proteínas da matriz laminina, fibronectina e colagéneo I. De facto, a expressão destas proteínas excepto o colagéneo foi afectado tanto a nível molecular e proteico. Mais ainda verificamos a expressão dos seus genes por reacção em cadeia da polimerase (PCR). Onde a nível molecular o gene da laminina está sobre expressa em ambas as condições de criopreservação, o gene da fibronectina apenas na condição exprimental e o gene do colagéneo não sofre alterações significativas em ambas as condições de criopreservação. Considerando que as propriedades mesenquimais das células que compõe as cell sheets, são determinantes nos resultados previamente observados, a expressão dos marcadores típicos após a criopreservação foi analisado a nível genético e proteico, usando PCR e citometria de fluxo respectivamente. Com base nos resultados obtidos, que demonstram que a matriz extracelular é significativamente afectada pelo processo de criopreservação, será necessário testar diferentes protocolos e diferentes métodos de criopreservação, no sentido de se obter uma melhor preservação da integridade estrutural da cell sheet, e portanto garantir a sua funcionalidade após transplantação.

Regenerative Medicine (RM) englobes the multidisciplinary and interdisciplinary field of Tissue Engineering (TE) that aims to repair or enhance tissue or organ function. The field of TE takes advantage of the properties of three-dimensional (3D) structures that combined with different cells allow to recreate the native environment of a tissue. These 3D structures are produced with synthetic or natural materials, and aimed to have the ideal physical, mechanical and chemical proprieties for a better performance of cells, thus promoting the tissue regeneration. In context of TE, stem cells (SCs) are combined with the 3D structures or scaffolds, allowing the creation of viable and complex substitutes for tissue regeneration. The SCs have been largely used in TE due to its high proliferative rate, self-renewal capacity, ability to differentiate into different cell lineages. In the last decade the mesenchymal stem cells have been widely used in tissue engineering, they have the potential to proliferate and maintain undifferentiated with the ability to self-renew and / or differentiate into different cell types. There are various sources of stem cells with different characteristics used in TE, where they have the greatest impact are derived from spinal cord, blood and adipose tissue, among others located in different areas of the human body. The use of scaffolds, might promote an inflammatory response after transplantation, and the major part of used biomaterials are not biofunctional. One of the alternatives to solve this problem is the production of constructs without the use of traditional biomaterials. The Cell Sheet Engineering is the alternative because it uses the extracellular matrix deposited by the cells as a natural scaffold for the regeneration of different tissues. Cell sheet technology was originally proposed by Okano and co-workers, in early 90’s. This technology takes advantage of thermo-responsive culture dishes that enable reversible cell adhesion to and detachment from the dish surface by a controllable hydrophobicity of the surface. By temperature change, a cell sheet with organized cellular entities and cohesive cell-to-cell and cell-ECM interactions is obtained. In previous studies in our laboratory we generated cell sheets from human stem cells derived from adipose tissue (hASCs) that after transplantation in mice full-thickness excisional skin wounds, induced the formation of rete ridged-like structures and a significant number of hair follicles. Considering these results and envisioning the possibility of having cell sheets available off-the-shelf for immediate use in the clinic, to have these structures cryopreserved would be advantageous. The goal of this work was to define a cryopreservation methodology that allows the preservation of both cells viability and the properties of CS extracellular matrix (ECM). hASCs obtained from three different donors, were cultured in UP cell thermoresponsive dishes, to form hASCs-CS. Different cryopreservation conditions were considered, by varying the concentration of DMSO: i) standard condition with 10% of DMSO used to cryopreserve cell suspension; and ii) experimental condition with 5% of DMSO to reduce the cytotoxicity. The effect of cryopreservation conditions over cell viability was analysed after dissociation of the CS. The results showed that both cryopreservation conditions do not significantly affect cell viability. However the cytoskeleton of cells suffered alterations after cryopreservation in both conditions, which were more evident in the standard condition. It was also found that both cryopreservation conditions affect the integrity of the extracellular matrix of cell sheets, although it appears that a standard condition affecting more significantly. Furthermore, after cryopreservation the amount of total protein, decreased to half, which indicates that both conditions of cryopreservation affects the extracellular matrix content. Potentially, this result is associated with matrix proteins laminin, fibronectin and collagen type I. In fact, these proteins other than collagen was affected both molecular and protein level. Moreover we found the expression of their genes by polymerase chain reaction (PCR). Where the molecular level, the laminin gene is over expressed in both the cryopreservation conditions, the fibronectin gene only in experimental condition and collagen gene does not change significantly in both the cryopreservation conditions. Whereas the properties of mesenchymal cells that comprise the cell sheets are determining the results previously reported, the expression of typical markers following cryopreservation was examined at the genetic and protein level using PCR and flow cytometry, respectively. Based on the results obtained, showing that extracellular matrix is significantly affected by cryopreservation, is to experiment with different protocols and different methods of cryopreservation. In order to obtain a better preservation of the structural integrity of the cell sheet, and thus ensuring its functionality after transplantation. With this thesis, it was possible to open routes to target a suitable cryopreservation methodology applied to hASCs-CS, which enables an off-the-shelf TE and RM strategy.