Contribution to the study of prognostic factors in canine oral squamous cell carcinoma

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, na Especialidade de Clínica

The main goal of this clinical work was to contribute to the study of oral squamous cell carcinoma (OSCC) in the dog with regards to molecular and differentiation events, and their relationship with the tumor’s biological behavior – impact on the staging, prognosis or treatment. From the assessment of histological differentiation and proliferation index in a 36 OSCC case series, it was possible to identify a significant association between the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67, distribution pattern and histological differentiation. PCNA expression was significantly higher than Ki-67 and a higher proliferation index was associated with poorly differentiated OSCC, resembling what is observed in humans. With regards to intra-oral locations, poorly differentiated tumors were significantly associated with the tonsillar location. Proliferation index was not associated with any of the intra-oral locations evaluated, but it was found that metastatic lymph nodes were significantly associated with OSCC with higher poliferation index. OSCC prognosis was assessed in a 13 case series where the age of the animal and tumor size, location, grade and proliferation were evaluated as post surgical prognostic factors. All cases were standardized – CT staged and clinically managed over a period of 2 years, with bone invasion, no lymphatic invasion nor distant metastasis. The results obtained indicated that grade and proliferation index were related with post operatory prognosis. Animals with high-grade tumors had shorter disease free survival times when compared to intermediate grade tumors. Also animals with high-grade tumors and with high PCNA proliferation index showed a significantly worse post-surgical prognosis. The immunohistochemical expression of the cell adhesion molecule E-cadherin and p63 protein were assessed and related with histological and clinical features at time of diagnosis in a 22 case series. Changes in p63 and E-cadherin expression seem to be frequent molecular events in canine OSCC. It was observed that p63 was overexpressed in all cases and E-cadherin was found to be underexpressed in most cases. Furthermore, p63 expression was related to the proliferation and there were different expression patterns related to tumor grade. None of the histological or immunohistochemical parameters were associated with tumor size, bone invasion or lymph node metastasis. More than the contribution to the knowledge of some of the molecular events involved in this tumor, this work explores the clinical applicability of such markers, especially proliferation, in a practical veterinary clinical setting, ilustrated in this work with one case report. This thesis also explores the potential use of the dog as a model in comparative oncology studies.

RESUMO - Contributo para o estudo de fatores de prognóstico no carcinoma oral de células escamosas no cão - O carcinoma de células escamosas é o segundo tumor não-odontogénico mais frequente na cavidade oral do cão. Embora a cirurgia possa ser curativa, na maior parte dos casos o diagnóstico ocorre numa fase tardia da doença ou então a localização anatómica inviabiliza o processo de cura por excisão cirúrgica. O prognóstico permanece, por isso, reservado uma vez que o carcinoma oral de células escamosas (COCE) se encontra associado a uma elevada taxa de recorrência pós-cirúrgica, sendo frequentes os casos inoperáveis. Neste contexto, torna- se pertinente aumentar o conhecimento do comportamento biológico deste tumor com o objetivo de melhorar a abordagem terapêutica, utilizando protocolos multimodais, adjuvantes ou neoadjuvantes que aumentem as possibilidades de cura. Esta tese surge assim com o objetivo de contribuir para o estudo do COCE no cão, aprofundando o conhecimento de fenómenos moleculares com potencial importância clínica. Em particular, procurou-se avaliar a expressão das proteínas Ki-67, PCNA, Caderina-E e p63, tendo sido estudada a sua relação no comportamento biológico do COCE, no estadiamento, na abordagem clínica e no prognóstico. Estas proteínas desempenham um papel relevante na iniciação e na progressão do COCE, estando associadas à diminuição das características epiteliais das células escamosas, podendo estar, à semelhança do verificado no humano, envolvidas no prognóstico. O antigénio Ki-67 é uma proteína nuclear estritamente associada à proliferação celular, sendo expressa em todas as fases ativas do seu ciclo. Tem sido alvo de estudos recentes no que diz respeito à sua função real no ciclo celular. O PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), o antigénio nuclear de proliferação celular, é uma proteína auxiliar das polimerases de DNA, envolvida também em funções de reparação, mas utilizada como marcador de proliferação. A proteína p63 pertence à família de proteínas do gene p53, estando ligada aos processos de diferenciação e sobrevivência das células epiteliais. A caderina-E é uma glicoproteína dependente de cálcio, necessária nos mecanismos de adesão celular. Trinta e seis casos de COCE avaliados de forma retrospetiva resultaram da compilação inicial de 23 casos reunidos de forma consecutiva entre Janeiro de 2008 e Janeiro de 2012 de vários centros de atendimento médico veterinário em Portugal e, posteriormente, 13 casos foram fornecidos por um único centro de atendimento veterinário, entre Janeiro de 1995 e Janeiro de 2013. Apenas os animais submetidos a estadiamento clínico e cirurgia para realização de exérese ou biópsia foram incluídos no estudo. Vinte e três casos foram acompanhados durante um período de 2 anos. As variáveis idade, raça, sexo, peso corporal, localização e tamanho do tumor, invasão óssea e metástases linfáticas foram registados no momento do diagnóstico, sendo, posteriormente a recorrência, o tempo de sobrevivência e a sobrevivência livre de doença registados durante um período pós-cirúrgico de 2 anos. Vinte e três amostras de COCE foram fixadas em formalina tamponada a 10% e incluídas em parafina para exame histológico de rotina e para estudo imunohistoquímico. Neste, foram utilizados os anticorpos primários anti-Ki-67 (Mib-1, Dako), anti-PCNA (clone PC-10, Novocastra), anti-p63 (clone 4A4, VENTANA) e anti-caderina-E (clone 36, VENTANA) e o sistema de deteção Novolink Max Polymer, Novocastra. Desta amostra inicial foi eliminado um caso, por ausência de marcação com caderina-E, e foi identificado um grupo de 13 casos de invasão óssea e sem metastização linfática. Posteriormente, 12 amostras foram submetidas a estudo imunohistoquímico para Ki-67 e PCNA. Os resultados obtidos nesta série de 36 casos revelaram que os padrões de expressão dos marcadores Ki-67 e PCNA assemelham-se ao observado no COCE humano, sendo a expressão de PCNA proporcionalmente mais elevada do que a de Ki-67. Foi encontrada uma associação entre a proliferação e a diferenciação em que um elevado índice de proliferação encontrava-se significativamente associado com tumores pouco diferenciados. Por sua vez, os tumores pouco diferenciados encontravam-se associados com a localização tonsilar. Não foi encontrada qualquer associação entre o índice de proliferação e a localização anatómica, estádio clínico ou invasão óssea. No entanto, identificou-se uma associação com significado estatístico entre o índice de proliferação e a presença de linfonodos regionais metastizados na altura do diagnóstico. Foi possível identificar, durante o estudo clínico, uma série de 13 casos de COCE, com estadiamento efetuado por tomografia e acompanhamento durante um período de 2 anos. Neste estudo, todos os casos apresentavam invasão óssea, mas ausência de metastização linfática ou distante. De todos os fatores de prognóstico estudados – nomeadamente, a idade, o tamanho do tumor, a localização anatómica, o grau histológico e o índice de proliferação do PCNA – somente o grau histológico e o índice de proliferação do PCNA apresentaram uma associação significativa com o prognóstico. Foi identificada uma sobrevida média livre de doença inferior para os animais com tumores de alto grau comparativamente com os tumores de grau intermédio. Por sua vez, os animais com tumores de alto grau e com índice de proliferação do PCNA elevado apresentavam um prognóstico pós-cirúrgico significativamente mais pobre. A idade, o tamanho do tumor e a localização anatómica não apresentaram influência no prognóstico. Por fim, a expressão imunohistoquímica de caderina-E e de p63 foi avaliada em 22 casos de COCE. Neste trabalho, avaliou-se a relação destes marcadores com parâmetros clínicos, com a diferenciação histológica e com o PCNA. Os resultados obtidos permitiram verificar que as mudanças da expressão de p63 e de caderina-E são acontecimentos frequentes no COCE do cão, à semelhança do que ocorre em humanos. Especificamente, foi possível identificar que em todos os casos de COCE existe uma sobrexpressão de p63, estando esta sobrexpressão relacionada com o índice de proliferação. Na maioria dos casos, a expressão de caderina-E encontrava-se diminuída, sendo esta sobretudo citoplasmática em vez de membranar, consistentemente observada nos epitélios normais. Nenhum dos parâmetros imunohistoquímicos estudados se encontrava associado com o tamanho do tumor, a invasão óssea ou a presença de metástases linfáticas. Foi observada a existência de diferentes padrões de expressão relacionados com o grau do tumor. Os padrões atípicos de p63 encontravam-se relacionados com os tumores de alto grau, e estes, por sua vez, apresentavam-se significativamente associados a uma expressão citoplasmática de caderina-E. Estes dois marcadores parecem funcionar como reguladores moleculares no equilíbrio fenotípico epitélio-mesenquimatoso das células tumorais. Mais do que o contributo para o conhecimento de alguns dos fenómenos moleculares envolvidos no COCE no cão, o presente trabalho explora a potencialidade da utilização destes marcadores na prática clínica, o que é especialmente ilustrado por um caso clínico. Esta tese explora também a potencial utilização do cão como modelo animal em estudos de oncologia comparada.