Purification, biochemical characterization and localization at single cell resolution of Matrix Gla Protein (MGP) and Bone Gla Protein (BGP) in the teleost fish Argyrosomus regius

Tese de dout. em Química, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2002

Matrix Gla protein (MGP) and Bone Gla Protein (BGP, osteocalcin) belong to the family of vitamin K dependent (VKD), Gla containing proteins. Matrix Gla protein (MGP) is a 10-15 kDa secreted protein with 4-5 residues of the Ca2+ binding y-carboxyglutamic acid residue (depending on the species). MGP was previously found to accumulate within the organic matrix of mammalian bone, from which it was originally purified. In mammals, birds and Xenopus, its mRNA was previously detected in extracts of bone, cartilage and soft tissues (mainly heart and kidney) while the protein was found to accumulate mainly in bone. However, at that time it was not evaluated if this accumulation originated from protein synthesized in cartilage or in bone cells since both co-exist in skeletal structures of higher vertebrates and Xenopus. Later reports showed that MGP also accumulated in costal calcified cartilage as well as at sites of heart valves and arterial calciflcation. Interestingly, MGP was also found to accumulate in vértebra of shark, a cartilaginous fish. But to date, no information is available on sites of MGP expression or accumulation in teleost fishes, the ancestors of terrestrial vertebrates, who have in their skeleton mineralized structures with both bone and calcified cartilage. BGP is a small secreted protein with 46-50 residues including three potential Ca24 binding y-carboxyglutamic acid residues. This protein is the most abundant non-collagenous protein found in mammalian bone from which it was first isolated. BGP has been known for a number of years to be present in teleost fishes. nevertheless there is little information about the regulation of expression and tissue localization of this protein in lower vertebrate organisms and in particular in fish. This report describes, for the first time the identification of MGP in a teleost fish, with the protein purification and molecular cloning of MGP and BGP from the same teleost fish, Argyrosomus regius. The obtention of valuable biochemical tools such as specific antibodies and mRNA/DNA probes also permitted the study of tissue distribution/accumulation for MGP/BGP by Northern analysis, in situ hybridization and immunohistochemistry. In mineralized tissues, the MGP gene was predominantly expressed in chondrocytes from branchial arches, with no expression detected in the different bone-like mineralized tissues analyzed while BGP mRNA was mainly located in bony tissues as expected. Accordingly,the MGP protein was found to accumulate, by immunohistochemical analysis, mainly in the extracellular matrix of calcified cartilage. These results show that in marine teleost fish, as in mammals, the MGP gene is expressed in chondrocyte-containing tissues. However and in contrast with results obtained for Xenopus and higher vertebrates, the protein does not significantly accumulate in vertebra of non-osteocytic teleost fish (such as A. regius) but only in its calcified cartilage. As previously seen in mammals and Xenopus, MGP was also found in soft tissues predominantly in heart and kidney. Our results indicate, in addition, that the presence of MGP mRNA in heart tissue is due, at least in físh, to the expression of the MGP gene in two specific cell types only, smooth muscle and endothelial cells, while no expression was found in the striated muscle fibers of the ventricle. In light of these results and in agreement with recent information on expression of the MGP gene in these same cell types in mammalian aorta, it is likely that the presence of MGP mRNA previously detected in Xenopus, birds and mammalian heart tissue may be due to expression of the gene only in smooth muscle and endothelial cells. Our results provide clear evidence that fish represem a valuable model system to study MGP/BGP gene expression and regulation, to bring further insight into its mode of action at the molecular levei throughout evolution.

As proteínas Matrix Gla Protein (MGP) e Bone Gla Protein (BGP, osteocalcina) pertencem ambas à família de proteínas secretadas dependentes da vitamina K que contêm Gla. A proteína Matrix Gla (MGP) com um peso molecular de 10-15 kDa que contém 4-5 resíduos do aminoácido y-carboxiglutamato que coordenam o ião Ca2+. Esta proteína foi originalmente purificada da matriz orgânica de osso de mamífero, onde foi detectada a sua acumulação. Em mamíferos, aves e Xenopus, o seu ARNm foi previamente detectado em extractos de osso, cartilagem e tecidos moles (nomeadamente coração e rim), enquanto a sua acumulação era essencialmente detectada em osso. No entanto, na época não era evidente se esta acumulação teria origem a partir de proteína sintetizada em cartilagem ou em células de osso, dado que ambas coexistem em estruturas de esqueleto de vertebrados superiores e Xenopus. Dados posteriores demonstram em mamíferos a acumulação de MGP em cartilagem calcificada da região costal, bem como em algumas zonas das válvulas do coração e em artérias calcificadas. Foi também detectada a acumulação de MGP em vértebra de tubarão, um peixe cartilagíneo. Até à data não existe informação acerca dos sítios de expressão ou acumulação de MGP em peixes teleosteos, os ancestrais dos vertebrados terrestres, que contêm no seu esqueleto estruturas mineralizadas com osso e cartilagem calcificada. A BGP é uma pequena proteína (46-50 resíduos) com três • ** 2"F T-* ' resíduos de y-carboxiglutamato responsáveis pela coordenação do ião Ca . Esta e a proteína não colagénica mais abundante encontrada em osso de mamífero, a partir do qual foi inicialmente isolada. Desde há alguns anos se sabe que a BGP se encontra presente em peixes teleosteos, no entanto é escassa a informação no que respeita à regulação da expressão e localização nos tecidos desta proteína em organismos vertebrados inferiores. Este trabalho descreve pela primeira vez a identificação da MGP num peixe teleósteo, assim como a purificação e a clonagem de ambas as proteínas BGP e MGP, esta pela primeira vez, isoladas do mesmo peixe Argyrosomus regius. A obtenção dos anticorpos específicos e das sondas de ARNm/ADN permitiram o estudo da distribuição/acumulação nos tecidos por análise de tipo "Northern", hibridação in situ e imunohistoquímica. Em tecidos mineralizados, o gene da MGP é predominantemente expresso em condrócitos de arcos branquiais, não lendo sido detectada expressão nos diferentes tipos de tecidos osseos analisados, enquanto que o ARNm da BGP foi essencialmente detectado em tecidoósseo, como esperado. Do mesmo modo, a acumulação da MGP foi detectada por análise imunohistoquímica, essencialmente na matriz extracelular de cartilagem calcificada. Em tecidos moles, o ARNm da MGP é detectado no coração, mas estudos realizados por hibridação in situ permitem concluir que as células responsáveis pela expressão do gene da MGP localizam-se no bulbus arteriosus e parede aórtica, ricos em células de músculo liso e células endoteliais. No entanto não foi detectada expressão nas fibras miocardicas do músculo estriado do ventrículo. Em contraste com os resultados obtidos para Xenopus e vertebrados superiores, não é detectada acumulação significativa da MGP em vértebra de peixe teleósteo não osteócitico, mas somente em cartilagem calcificada. Adicionalmente os resultados indicam também que a presença do ARNm da MGP no tecido do coração em peixe é devido à expressão do gene da MGP somente em dois tipos de células; células endoteliais e células de músculo liso, não tendo sido detectada expressão nas fibras miocárdicas do músculo estriado do ventrículo. À luz destes resultados e informação recente sobre a expressão do gene da MGP neste mesmo tipo de células em aorta de mamíferos, é provável que a presença de ARNm previamente detectados em Xenopus, aves e tecido do coração de mamíferos, seja restrito, a regiões ricas em músculo liso e células endoteliais. Os resultados obtidos evidenciam o papel do peixe como um sistema modelo no estudo da expressão e regulação dos genes da MGP/BGP e fornecer informação pertinente quanto ao modo de acção destas proteínas a nível molecular ao longo de evolução.