Identification of regulatory polymorphisms associated with breast cancer risk

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

O cancro da mama é uma das patologias oncológicas mais comuns, e causa de morte mais frequente entre as mulheres. Trata-se de uma doença complexa com fatores genéticos e não genéticos envolvidos na sua etiologia. Até ao momento, o conhecimento adquirido acerca do risco genético não explica mais do que dois terços dos casos de cancro familiares permanecendo ainda por explicar cerca de 65% a 70%. Com os recentes avanços na tecnologia de microarrays e nos estudos de associação realizados a nível de genoma inteiro (genome-wide association studies, GWAS), têm surgido evidências que sugerem que as variantes cis-reguladoras podem ser importantes para o risco de cancro da mama. Variantes cis-reguladoras são polimorfismos que regulam a expressão de genes. Podem-no fazer através da modificação de elementos reguladores como, por exemplo: afetando a ligação de fatores de transcrição em promotores e elementos intensificadores Essas variantes são frequentes na população e contribuem para a variabilidade intra e inter -espécies. Com base nestas evidências, a nossa hipótese consiste em que a maioria dos polimorfismos comuns e associados a risco ainda por identificar podem ser também cis-reguladores. Deste modo, a procura para a restante suscetibilidade genética do cancro da mama deve centrar-se nas variantes com maior potencial cis-regulador. As variantes cis-reguladoras podem ser identificadas de diferentes formas, como por exemplo através de loci de características quantitativas de expressão (expression quantitative trait loci, eQTL) e análises de expressão diferencial alélica (differential allelic expression, DAE) em indivíduos heterozigóticos. DAE é uma abordagem que compara os níveis relativos de expressão dos dois alelos do mesmo gene em indivíduos heterozigóticos, utilizando um SNP transcrito (tSNP). Esta técnica tem revelado ser bastante eficaz, uma vez que compara os níveis de transcritos dos alelos dentro do mesmo contexto celular e de haplótipos, pelo que a influência de efeitos trans é eliminada (por exemplo concentração de fatores de transcrição no núcleo). Este trabalho teve dois grandes objetivos: o primeiro, a validação da dos resultados de DAE nos polimorfismos cis-reguladores identificados num estudo anteriormente realizado pela Prof. Ana Teresa Maia; o segundo, a identificação de novos loci envolvidos no risco para o cancro da mama. No estudo para validação da DAE, foi medida a quantidade relativa da expressão dos dois alelos de 10 SNPs, previamente identificados como apresentando DAE (rs2526935; rs10503416; rs10513376; rs7600326; rs6494466; rs10016; rs13265801; rs9250; rs8097892; rs1384) e de 4 SNPs sem DAE (rs2834653; rs710945; rs1477017 e rs10521). Foram utilizadas 18 amostras de tecido mamário de indivíduos saudáveis e os níveis da DAE foram determinados utilizando a técnica de PCR em tempo real específica alélica. As distribuições de DAE foram comparadas aplicando um Teste t de Student (t-test), o qual compara as médias da distribuição de rácios de DAE. No total dos 10 SNPs com DAE validámos 6 SNPs que eram consistentes com os resultados observados anteriormente. Apenas um de quatro SNPs sem evidências da DAE mostrou consistência com os resultados anteriores. Para o estudo de identificação de novos loci foi aplicada uma abordagem inovadora, a qual consiste no cruzamento de dados para cancro da mama publicados nos GWAS com os nossos dados de DAE. Esse cruzamento de dados é feito de acordo com a localização cromossómica, distância física (janelas de ±250kb a partir da variante com DAE) e padrões de desequilíbrio de ligação (linkage disequilibrium, LD). Com este exercício pretendemos testar se esta abordagem pode ajuda a priorizar os loci candidatos de GWAS para validação e posteriores análises funcionais. Este cruzamento de dados permitiu identificar vários loci que contêm SNPs associados com risco para cancro da mama e SNPs com DAE. Para uma análise inicial selecionaram-se dois loci: 17q22 (TOM1L1/COX11/STXBP4) e 12q24 (AACS), com base nos cenários de DAE, LD entre o tSNP de DAE e o SNP do GWAS. Esses dois loci foram inicialmente analisados para potenciais elementos reguladores e evidência funcional (promotores, intensificadores e ligação de fatores de transcrição) nos locais onde se encontram os candidatos a variantes cis-reguladoras. Para essa análise foram utilizadas uma base de dados, RegulomeDB, e um navegador de informação genómica, Genome Browser, que contêm informações sobre hipersensibilidade à desoxirribonuclease (DNAse), TFBS, e regiões promotoras, evidências obtidas em estudos in silico e/ou in vitro para variantes codificadoras e não codificadoras. No locus 17q22, foram encontrados 12 SNPs em sobreposição com regiões que contêm marcadores para elementos funcionais, tais como promotores e intensificadores. Sugerindo que esses podem possivelmente ter um efeito funcional através da regulação da expressão do gene. Posteriormente, analisaram-se os SNPs para a estrutura de LD nessa região e para identificação dos haplótipos na população os quais podem ser responsáveis pelo aumento ou diminuição na expressão dos genes. Foram identificados quatro haplótipos comuns associados com diferenças nos níveis de expressão. No locus 12q24, o tipo de análises realizadas foram as mesmas descritas para o outro locus. Para o locus 12q24 foram encontrados 13 SNPs em sobreposição com regiões contendo elementos reguladores o que sugere um possível efeito funcional na regulação da expressão dos genes. Todos SNPs foram também analisados para a estrutura de LD e identificação de haplótipos. Com base nessa análise, foram identificados quatro haplótipos comuns associados com as diferenças nos níveis de expressão. Essas variantes candidatas a serem cis-reguladoras foram selecionadas com base em análises in silico, utilizando ferramentas para a previsão de potenciais locais de ligação de fatores de transcrição. Posteriormente, 3 SNPs foram analisadas funcionalmente in vitro, numa linha celular de cancro da mama (HCC1954). Como os genes presentes em cada um dos loci mostraram evidências para a presença de variantes cis-reguladoras, decidiu-se validar os níveis de DAE em tecido de mama normal e compará-las com os níveis de DAE no sangue. Para essa análise usou-se um tSNP para cada gene (rs17817901 no COX11 e rs7138557 no AACS). Validaram-se os resultados da DAE, no tecido da mama, e para o AACS e observou-se que esses não são comparáveis com os níveis da DAE no sangue. Os nossos resultados não suportam, portanto, o uso de sangue em estudos de DAE em substituição para o tecido da mama, na aplicação futura em estudos de predisposição ao cancro da mama. Para averiguar se a DAE em ambos os loci está realmente associada com o risco de cancro de mama, foi realizado um estudo de caso-controlo. Foi encontrada uma associação significativa neste estudo, o que sugere que DAE em ambos os loci deve ser futuramente explorado como instrumento de previsão de risco para cancro da mama. Futuramente, uma análise mais aprofundada da regulação destes genes poderá levar também à compreensão da biologia de predisposição ao tumor e contribuir para o desenvolvimento de terapias futuras, especialmente na área da medicina personalizada.