Physiology and biochemistry of the effect of abiotic stress on the autochthonous CTP4 strain, a candidate microalga for biofuel production in Algarve

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Os combustíveis fósseis são recursos finitos. Como tal é imperativo encontrar fontes renováveis de energia. Os biocombustíveis de microalgas são uma promissora forma de energia alternativa. No entanto, é urgente encontrar e produzir microalgas mais produtivas para tornar o processo de produção numa opção viável e rentável. Recentemente o grupo MarBiotech isolou uma microalga verde, através de sorteamento de células ativada por fluorescência, mostrou ser capaz de crescer em efluentes de ETAR e possuir um conteúdo lipídico de 20% em condições não indutivas. Uma vez que esta estirpe ainda não identificada até ao género/espécie, ela foi denominada CTP4. Neste trabalho, esta microalga foi submetida a stress abiótico, nomeadamente a temperaturas altas e baixas (35 ºC e 5 ºC, respetivamente) e a elevada intensidade luminosa (200 e 400 μmol m-2 s-1) sob condições de depleção e suplementação de nutrientes. As culturas usadas como controlo foram crescidas a 20ºC e a uma densidade de fluxo de fotões (PFD) de 100 μmol m-2 s-1. Esta microalga foi cultivada à escala laboratorial, sendo o seu crescimento medido a cada dois dias através da concentração celular e do peso seco. De modo a tornar mais expedito a determinação do crescimento da cultura, a densidade ótica medida a 540 e 750 nm foi positivamente correlacionada com a concentração celular e com o peso seco. Assim, foram traçadas as curvas de calibração para cada correlação, tanto para a densidade ótica com a concentração celular, como para a densidade ótica com o peso seco. O conteúdo lipídico foi determinado através do método gravimétrico Bligh & Dyer (1959) e foi positivamente correlacionado com a fluorescência do vermelho do Nilo, de modo a facilitar a experiência da indução lipídica. As culturas demoraram cerca de 11 dias a atingir a fase estacionária (2,7x106 células mL-1), tendo o inóculo inicial uma concentração de 2x105 células mL-1. Depois da obtenção das curvas de calibração, as culturas foram stressadas e cultivadas durante 7 dias num sistema de crescimento bifásico, após o início da fase estacionária, de modo a permitir que as células atingissem a máxima concentração celular possível. A acumulação de lípidos foi assegurada pela imposição de stress abiótico, nomeadamente variações da temperatura, intensidade luminosa e adição ou depleção de nutrientes. Um padrão registado em todos os ensaios foi o efeito da depleção de nutrientes, o que levou a uma maior acumulação de lípidos em todas as culturas (19,4-40,2%) quando comparadas com culturas com suplementação de nutrientes sob as mesmas condições de indução (8,3-24,4%). O fator de indução mais promissor foi a intensidade luminosa a 400 μmol m-2 s-1, sob depleção de nutrientes ao 7º dia (7,3%-40.2%). Estes resultados obtidos com o vermelho do Nilo foram depois comprovados por microscopia de fluorescência usando o fluorocromo solvatocrómico BODIPY 505/515. Como esperado, existe uma maior quantidade de gotas lipídicas nas culturas sob stress abiótico. As microalgas têm a capacidade de produzir vários compostos bioativos de elevado valor. Assim sendo, a viabilidade económica da produção de biocombustíveis de microalgas pode ser melhorada por co-produtos de elevado valor, os quais poderiam ser extraídos da biomassa colhida. Deste modo, a produção de biocombustíveis e co-produtos de elevado valor poderia ser realizada de uma forma rentável e ecologicamente sustentável. Em consequência, a última parte do trabalho prende-se com o perfil bioativo e o processo de colheita da biomassa da microalga em estudo. Para isso, foram cultivadas 2 mangas de 100 L durante 18 dias, com suplementação e depleção de nutrientes e a sua colheita foi feita através da interrupção do arejamento por 48 horas e posterior centrifugação da restante biomassa. Os extratos foram preparados após liofilização do material colhido, com acetona, metanol, acetato de etilo e hexano, sendo posteriormente dissolvidos em DMSO às concentrações de 1, 5 e 10 mg mL-1 para a realização de ensaios relativos às atividades antioxidante e de 1 mg mL-1 para a atividade antidiabética. A atividade antioxidante foi avaliada através da atividade sequestradora de radicais com radicais de ABTS. Todos os extratos mostraram uma atividade sequestradora de radicais elevada para a concentração máxima (10 mg mL-1), atingindo 87,7% de inibição com o extrato de metanol a uma concentração de 10 mg mL-1. A atividade antidiabética foi investigada a partir da inibição da enzima α-amilase, responsável pela hidrólise do amido, reduzindo a absorção de glucose. Os extratos de hexano, tanto de culturas sujeitas a depleção como a suplementação de nutrientes mostraram valores de inibição superior a 1, o que sugere atividade inibitória. Por outro lado, todos os outros extratos apresentaram valores inferiores à unidade, representando uma atividade estimuladora da amilase. Em conclusão, estes resultados indicam que a estirpe CTP4 é uma microalga promissora para a co-produção de biodiesel e compostos bioativos, os quais poderão ser utilizados para tornar rentável o processo de scale-up e produção em larga escala. Palavras-chave: biocombustível; microalgas; indução lipídica; atividade antioxidante; atividade antidiabética; EMAG.