Cited2 in mouse embryonic fibroblasts reprogramming

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Células diferenciadas podem ser reprogramadas de modo a voltarem a ser pluripotentes e se transformarem em outros tipos de células através da inserção de factores específicos. No entanto a reprogramação de células somáticas de modo a se obter células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), tem um tempo de reprogramação é relativamente longo, a eficiência da reprogramação ainda é relativamente baixa, alguns dos factores de pluripotencia que são usados para este processo são pro-oncogenes, e ainda existe a dificuldade de ultrapassar a senescência. Através de células embrionárias fibroblasticas de ratinho (MEF’s) o objectivo é reprogramar com os 4 factores de transcrição idenficados como genes de pluripotencia, Sox2, Nanog, Klf4 e c-Myc, acrescentando o mais um factor de transcrição Cited2 e usando estas células nas passagens P2 e P4. O Cited 2 é um regulador de transcrição de genes envolvido em muitas cadeias de transcrição biológicas, sendo esta capaz de induzir a proliferação das células quer de ratinhos como de humanos, é considerado um “anti-senescente”, tem a capacidade de activar a transcrição dos genes envolvidos na pluripotencia. Para este trabalho foram criados vectores virais, dois retrovírus, sendo um deles o Cited2 de modo a ser sobreexpresso nas células contendo GFP acoplada (KRK1), outro apenas com GFP que servirá de controlo (LZRS) e dois lentivírus que permitiram a inserção e activação da transcrição dos 4 factores de Yamanaka (respectivamente TET STENCCA e M2RTTA). Serão analisadas morfologias das colonias obtidas através da reprogramação, serão feitos qRT-PCR às colonias de modo a se perceber se expressão os factores de pluripotência das células estaminais embrionárias (ESC), e se através da formação de corpos embrionários (EB’s) através das iPS obtidas estas são capazes de dar origem às três linhas germinativas, mesoderme, ectoderme e endoderme, este processo será realizado por qRT-PCR. Após análise dos resultados obtidos, pode-se concluir, que o Cited2 nas MEF’s P2 possibilita o aparecimento precoce dos agregados de colónias em relação às MEF’s que não têm Cited2 exógeno, enquanto nas MEF’s P4 com Cited2 sobreexpresso, consegue-se ultrapassar a senescência e obter-se iPS com valores bastante semelhantes entre si a nível da transcrição dos factores de pluripotencia (Nanog, Sox2, Oct4 e Rex1).