Isolamento e caracterização biológica e bioquímica de um activador do factor x da coagulação presente no veneno da serpente Bothrops erythromelas

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

O envenenamento por zootoxinas é um problema de saúde pública que, dependendo da região, pode ser muito grave; contudo, os venenos são substâncias com grande potencial no campo da medicina, diagnóstico e investigação. Neste trabalho foi isolada e caracterizada uma nova proteína do veneno da serpente Bothrops erythromelas com capacidade de activar o factor X da cascata da coagulação. Esta proteína foi obtida por uma cromatografia de filtração em gel com recurso à coluna TSKgel G2000SW (Tosoh BioScience®), tendo sido posteriormente caracterizada como uma proteína pertencente à família das metaloproteases com 49039 Daltons por espectrometria de massa. O ponto de clivagem desta proteína no factor X humano situa-se entre os aminoácidos Glu310-Ser311, sendo que fisiologicamente ocorre entre os aminoácidos Arg194-Ile195, ambos na cadeia pesada do factor X. A proteína agora identificada e caracterizada é capaz de activar o factor X mesmo com baixas concentrações de cálcio e a sua inibição só ocorre em presença de uma concentração elevada de EDTA. A importância desta proteína advém do facto da sua actividade se localizar no ponto de convergência da via intrínseca e extrínseca da cascata da coagulação, podendo eventualmente ter potencial como agente terapêutico, no que respeita à hemostase, como pro-coagulante ou como ferramenta em testes de diagnóstico e laboratoriais.

ABSTRACT - Isolation, biochemical and biological characterization of a coagulation factor X activator from the venom of the snake Bothrops erythromelas - Poisoning by zootoxins, depending on the region, is a serious public health hazard, however poisons are compounds with great potential in the medical, diagnosis and research field. In this work a new protein from the venom of Bothrops erythromelas snake has been isolated and characterized, which is capable of activating factor X of the coagulation cascade. This protein was obtained by gel filtration chromatography using TSKgel G2000SW column (Tosoh Bioscience®). The protein was subsequently characterized, by mass spectrometry, as a protein belonging to the metalloproteases family with 49039 Daltons. The cleavage site of the protein upon the human factor X lies between amino acids Glu310-Ser311 in contrast with what happens physiologically, which is located between amino acids Arg194-Ile195, both cleaving factor X on the heavy chain. This protein is still capable of activating factor X with very low concentrations of calcium and its inhibition occurs only with high concentrations of EDTA. The interest in this protein comes from the fact that its activity centers at the convergence point of the extrinsic and intrinsic pathway of the coagulation cascade, indicating a potential therapeutic agent, regarding haemostasis, as a procoagulant or as a tool on diagnostic and laboratory kits.