Protein disulfide isomerase as a target for besnoitiosis therapy : molecular characterization and studies of its role in infection and host immune response

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Sanidade Animal

amedmarcelino@fmv.ulisboa.pt

Besnoitia besnoiti is an apicomplexan parasite responsible for bovine besnoitiosis, a disease with a high prevalence in tropical and subtropical regions and re-emerging in Europe. Despite the great economical losses associated with besnoitiosis, this disease has been underestimated and poorly studied, and neither an effective therapy nor a vaccine to be used in Europe is available. Protein disulfide isomerase (PDI) is an essential enzyme for the acquisition of the correct three-dimensional structure of proteins. Current evidence suggests that in Neospora caninum and Toxoplasma gondii, which are closely related to B. besnoiti, PDI plays an important role in host cell invasion, is a relevant target for the host immune response, and represents a promising drug target and/or vaccine candidate. In this work, we presented the nucleotide sequence of the B. besnoiti PDI gene and a 3D theoretical model was built by comparative homology using Swiss-Model server. B. besnoiti expresses a PDI with 471 amino acids, structurally similar to human and yeast PDIs, with four thioredoxin-like domains a, b, b’, a’ and a C-terminal extension c. The a and a’ domains present the characteristic active site pattern CxxC, in this case CGHC and CGYC, respectively. Analysis of the phylogenetic tree for PDI within the phylum Apicomplexa reinforced the close relationship among B. besnoiti, N. caninum and T. gondii. Recombinant B. besnoiti PDI (recBbPDI) and truncated versions corresponding to domains a, b, b’ and a’c were expressed in a heterologous system. Mice were immunized with recBbPDI for the production of monoclonal antibodies (mAbs) by hybridoma technology and four mAbs were produced and characterized. RecBbPDI and domain a’c (recBb-a’c) were functionally active and exhibited a dose dependent cross-linking activity of insulin. In the presence of bacitracin, tocinoic acid, 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) and 4-chloromercuribenzoic acid (pCMBA) activity of both enzymes was inhibited, in a dose dependent manner. The same happened with recBbPDI in the presence of mAbs (with the exception of T8a), but not with recBb-a’c, whose activity was not sensitive to the presence of mAbs. In vitro proliferation of B. besnoiti tachyzoites was diminished in the presence of PDI inhibitors and anti-PDI mAbs, indicating that this enzyme seems to intervene in the process of host cell adhesion/invasion. In this way, considering the inhibitions obtained, both in the host cell invasion ability and in the enzyme catalytic activity, PDI can represent a potential target for addressing the treatment and/or prevention of besnoitiosis. The panel of monoclonal antibodies here developed represents an important tool for future studies.

RESUMO - A enzima isomerase de dissulfureto como alvo terapêutico contra a besnoitiose bovina. Caracterização molecular e estudo do seu papel na infeção e na resposta imunitária - Besnoitia besnoiti, o agente etiológico da besnoitiose bovina, pertence ao filo Apicomplexa, família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae, estando filogeneticamente próximo dos géneros Neospora e Toxoplasma. A besnoitiose bovina é uma doença severa mas geralmente não fatal, endémica em vastas áreas tropicais e subtropicais de África e responsável por elevadas perdas económicas. Na Europa, após as primeiras descrições há mais de um século, em França e Portugal, a doença recebeu pouca atenção até finais do século XX, altura em que a sua incidência começou a aumentar com relatos em Portugal, Espanha, Itália e França. Mais recentemente o avanço geográfico da doença é relatado com casos na Grécia, Suíça, Alemanha, Hungria, Croácia e Irlanda. A fase aguda da doença é marcada por alterações respiratórias, febre, anasarca, diarreia e, por vezes, aborto. Na fase crónica, o animal apresenta grande espessamento da pele (elefantíase) com soluções de continuidade, muitas vezes complicadas por infecções oportunistas, má condição corporal e, nos machos, orquite necrosante e aspermia. Apesar de ser conhecida há mais de um século, assim como a sua etiologia parasitária, a besnoitiose bovina mantém muitos aspectos da sua epidemiologia desconhecidos, incluindo o ciclo de vida do seu agente etiológico. Outras espécies do género Besnoitia têm um ciclo heteroxeno mantido por uma relação presa-predador entre pequenos mamíferos e o gato. Acredita-se que o ciclo de vida de B. besnoiti seja semelhante, mas até à data ainda não foi identificado um hospedeiro definitivo. A transmissão homoxena de bradizoítos e taquizoítos de B. besnoiti foi comprovada experimentalmente, em bovinos e em diversos animais de laboratório, e uma maior incidência da doença nos meses mais quentes do ano, quando existe maior actividade de insetos hematófagos, sugere um papel destes na transmissão de B besnoiti. No entanto, o verdadeiro modo de transmissão deste parasita na natureza mantém-se desconhecido. A doença pode atingir uma elevada taxa de morbilidade, o que, associado à gravidade das manifestações clínicas e à inexistência de vacina segura ou tratamento eficaz, justifica a necessidade de aprofundar o conhecimento sobre a biologia deste parasita, tentando desenvolver novas abordagens à terapêutica e à formulação de vacinas. A enzima isomerase de dissulfureto (PDI, do inglês protein disulfide isomerase), uma das mais abundantes do retículo endoplasmático, catalisa a formação de pontes dissulfureto e o rearranjo de emparelhamentos dissulfureto incorrectos, permitindo que as proteínas adquiram a sua correta conformação tridimensional. As suas funções (ou disfunções) têm sido implicadas em doenças neurodegenerativas como Alzheimer ou Parkinson ou na capacidade proliferativa de células neoplásicas. Sabe-se hoje que, para além da sua localização maioritariamente reticular, a PDI está presente à superfície das células, onde participa em diversas funções biológicas, como a ativação e agregação plaquetária, a adesão leucocitária ou a internalização de agentes patogénicos como alguns vírus e clamídias. Em diversos parasitas do filo Apicomplexa, incluindo Neospora caninum e Toxoplasma gondii, foram já identificadas PDIs na superfície dos taquizoítos e foi demonstrado que a inibição desta proteína, através de drogas ou anticorpos específicos, tem um efeito negativo sobre a capacidade de proliferação dos parasitas, evidenciando o papel que esta parece desempenhar no processo de adesão/invasão da célula hospedeira. Por outro lado, a PDI parece ter um papel relevante na resposta imunitária do hospedeiro, uma vez que foi identificada como uma proteína imunodominante e que foi demonstrada a presença de anticorpos anti-T. gondii-PDI e anti-N. caninum-PDI no repertório inato do homem e da vaca, respetivamente. Em conjunto, estas evidências sublinham a importância da PDI no processo de invasão celular e na resposta imunitária do hospedeiro. Neste trabalho determinámos a sequência completa do gene da PDI em B. besnoiti, clonámos o respectivo cDNA e expressámos a proteína recombinante, assim como versões truncadas da mesma, num sistema heterólogo. A PDI de B. besnoiti (BbPDI) pertence à superfamília das tiorredoxinas (cluster 00388), estando incluída na família PDI_a (cluster defined cd02961) e subfamília PDI_a_PDI_a’_c (cd02995). Construímos um modelo tridimensional da BbPDI por homologia de comparação usando o software disponível no servidor Swiss-Model e tendo como modelo a estrutura cristalográfica da Tapasina-ERp57 (código do PDB: 3F8U chain C). Verificámos que B. besnoiti expressa uma PDI composta por 471 aminoácidos, com a organização típica descrita para a PDI humana e de levedura, ou seja os 4 domínios estruturalmente semelhantes à tiorredoxina, domínio a, b, b’, a’, com uma extensão C-terminal c. Os domínios activos a e a’ apresentam os característicos centros ativos CxxC, no caso de B. besnoiti com a sequência aminoacídica CGHC e CGYC, respectivamente. A análise filogenética para a PDI colocou a B. besnoiti no mesmo ramo que a N. caninum e T. gondii. Com a PDI recombinante de B. besnoiti (recBbPDI), imunizámos murganhos com o objetivo final de produzir anticorpos monoclonais (mAbs) anti-PDI, pela tecnologia de hibridomas. Obtivemos 4 mAbs, que foram caracterizados no reconhecimento das versões truncadas de PDI, correspondentes aos domínios a, b, b’ e a’c e na capacidade de reconhecerem cruzadamente a PDI de N. caninum e T. gondii. Todos os anticorpos produzidos, T8a, S4a, R60b e S16p, reconhecem a proteína recombinante e a natural de B. besnoiti, tanto em condições desnaturantes como em condições nativas. Dois mAbs (T8a e S4a) reconhecem o domínio a’c, um anticorpo reconhece o domínio b’ (R60b) e o outro (S16p) não reconhece nenhuma versão truncada da proteína. O anticorpo T8a é específico para a PDI de B. besnoiti, enquanto os restantes reagem cruzadamente com a PDI de N. caninum e T. gondii, quando testados por western blot e ELISA. Foi avaliada a actividade cinética da proteína recombinante pelo método da agregação da insulina. Este consiste na avaliação turbidimétrica da precipitação da insulina como resultado da formação de pontes dissulfureto, ação que é catalisada pela PDI. Foram avaliadas as versões truncadas dos domínios ativos (a e a’c) e a proteína integral, tendo-se verificado ausência de atividade para a versão truncada correspondente ao domínio a. Contudo, a versão truncada a’c (recBb-a’c) e recBbPDI mostraram-se funcionalmente ativas. Na presença de bacitracina, ácido tocinóico, ácido ditionitrobenzoico (DTNB) e ácido p-cloromercurobenzóico (pCMBA) a atividade destas enzimas foi, de uma forma geral, inibida de um modo dose-dependente. O mesmo aconteceu com a atividade catalítica da recBbPDI quando testada na presença dos mAbs produzidos (excepto mAb T8a), mas não na actividade de recBb-a’c, que não foi inibida por nenhum dos mAbs. Verificou-se a presença de PDI no produto de secreção/excreção de taquizoítos e, para avaliar o envolvimento desta no processo de invasão da célula hospedeira, foram colocados taquizoítos de B. besnoiti sobre um tapete confluente de células Vero na presença das drogas e dos mAbs acima mencionados. Após uma hora, removeram-se os inibidores e os taquizoítos em suspensão e as culturas foram incubadas por mais onze horas para permitir a fácil visualização dos vacúolos parasitóforos, por imunofluorescência indireta. A presença de inibidores da PDI e de mAbs anti-PDI permitiram diminuir a taxa de invasão de B. besnoiti, demonstrando a acção desta enzima no processo de adesão/invasão da célula hospedeira. Tendo em conta os resultados de inibição obtidos, quer na capacidade de invasão de célula hospedeira, quer na atividade cinética da enzima, a PDI pode de facto representar um alvo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e/ou profilácticas contra a besnoitiose bovina. O painel de anticorpos monoclonais aqui desenvolvidos representa uma ferramenta importante para estudos futuros.