Avaliação da ação bioinseticida de SBTI e vicilina de Erythrina velutina em enzimas digestivas e membrana peritrófica de larvas de Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae)

Plodia interpunctella (Indian meal moth) is a cosmopolitan pest that attacks not only a wide range of stored grain as well other food products. Due to its economic importance several researches have focused in a method with ability to control this pest with few or no damage to the environment. The study of digestive enzymes inhibitors, lectins and chitin-binding proteins, has often been proposed as an alternative to reduce insect damage. In this study we report the major classes of digestive enzymes during larval growth in P. Interpunctella, being those proteinases actives at pH 9.5 and optimum temperature of 50 oC to both larvae of the 3rd instar and pre-pupal stage of development. In vitro and zymogram assays presented the effects of several inhibitors, such as SBTI, TLCK and PMSF to intestinal homogenate of 3rd instar larvae of 62%, 92% and 87% of inhibition and In pre-pupal stage of 87%, 62 % and 55% of inhibition, respectively. Zymograms showed inhibition of two low molecular masses protein bands by TLCK and that in presence of SBTI were retarded. These results are indicative of predominance of digestive serine proteinases in gut homogenate from Plodia interpunctella larvae. This serine proteinase was then used as a target to evaluate the effect of SBTI on larvae in in vivo assay. Effect of SBTI on mortality and larval mass was not observed at until 4% of concentration (w/w) in diets. Chitin, another target to insecticidal proteins, was observed by chemical method. Moreover, optic microscopy confirmed the presence of a peritrophic membrane. Established this target, in vivo effect of EvV, a chitin binding vicilin, evaluated during the larval development of P. interpunctella and was obtained a LD50 of 0,23% and WD50 of 0,27% to this protein. Mechanism of action was proposed through of the in vivo digestibility of EvV methodology. During the passage through the larval digestive tract was observed that EvV was susceptible to digestive enzymes and a reactive fragment, visualized by Western blotting, produced by digestion was recovered after dissociation of the peritrophic membrane. The bound of EvV to peritrophic membrane was confirmed by immunohystochemical assays that showed strong immunofluorescent signal of EvV-FITC binding and peritrophic membrane. These results are a indicative that vicilins could be utilized as potential insecticide to Plodia interpunctella and a control methods using EvV as bioinsecticide should be studied to reduce lost caused by storage insect pests

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Plodia interpunctella (traça-indiana-da-farinha) é uma praga cosmopolita que ataca não somente uma ampla gama de produtos armazenados, mas também outros produtos alimentícios. Devido a sua importância econômica várias pesquisas têm sido realizadas com o intuito de identificar um método capaz de controlar esta praga sem danos ao ambiente. O estudo de inibidores de enzimas digestivas, lectinas e proteínas que se ligam à quitina tem sido proposto como uma alternativa para controlar o dano causado por estes insetos. Neste estudo alvos específicos para inibidores de enzimas e proteínas ligantes à quitina foram identificados nas larvas desta praga. Para isso, durante o desenvolvimento de larvas de P. interpunctella as classes de enzimas digestivas alvos foram identificadas por ensaios de atividade in vitro e SDS-PAGE, pH e temperatura ótimos avaliados para a indicação de possíveis proteínas inibidoras para a principal classe de proteinase detectadas no intestino das larvas. Outro alvo para proteínas deletérias foi indicado pela identificação da membrana peritrófica por ensaios químicos de detecção de quitina e por microscopia de luz. Durante o período de desenvolvimento as larvas de P. interpunctella, alimentadas com uma dieta baseada em bagaço de cana, passaram por 5 ínstares e pelo estágio pré-pupal. A maior atividade proteolítica (UA/intestino) foi detectada no estágio pré-pupal, enquanto que a maior atividade proteolítica específica (UA/mg proteína) foi observada no terceiro ínstar, utilizando azocaseína como substrato a pH 9,5 e a 50°C. A inibição das proteinases presentes no homogenato intestinal de larvas de terceiro ínstar foi mais evidente quando inibidores de proteinases serínicas (SBTI, TLCK e PMSF, com 96%, 89% e 20% de inibição, respectivamente) foram utilizados nos ensaios. No estágio pré-pupal, a maior inibição observada foi com SBTI (96%), TLCK (81 %) e TPCK (20%), indicando a predominância de atividade enzimática de proteinases serínicas a pH 9,5 no intestino de Plodia interpunctella. Por zimograma foi observada inibição de bandas de menor massa molecular por TLCK e um atraso na corrida eletroforética dessas bandas causado por SBTI. Quando avaliado o efeito in vivo de SBTI no desenvolvimento larval, não foi observada mortalidade e nem efeito na massa das larvas sobreviventes. Estabelecido o segundo alvo de atuação, baseado na ligação à quitina, bioensaios usando a vicilina EvV foram realizados, onde um LD50 de 0,23% e um WD50 de 0,27% foram estabelecidos para esta proteína deletéria. O mecanismo de ação foi verificado por ensaios de digestibilidade de EvV durante a passagem pelo trato intestinal larval, sendo observado o envolvimento de um fragmento reativo, observado por imunodetecção, no efeito deletério da vicilina. A ligação de EvV à membrana peritrófica foi comprovada através de ensaios de imunohistoquímica. Estes resultados apontam para uma vicilina ligante à quitina que pode vir a ser utilizada como bioinseticida para Plodia interpunctella