Desenvolvimento de sistema automatizado para o monitoramento da degradação de resíduos de brometo de etídio

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015.

O Brometo de Etídio (BE) é um composto fluorescente que tem seu rendimento quântico muito aumentado quando intercalado à moléculas de DNA e RNA e, por isto, é usado para detecção destas espécies em procedimentos de eletroferese em gel. Devido a estas características, esta substância é considerada perigosa, pois pode causar danos ao material genético humano sendo classificado como um agente mutagênico /tóxico. Para realização do seu descarte é necessário um processo de inertização, sendo um dos mais aplicados o proposto por Lunn e Sansone em que são utilizados o ácido hipofosfórico e o nitríto de sódio para oxidação da substância. Porém, esta é uma reação de longa duração e a sua finalização deve ser atestada com o uso da detecção por fluorescência. Considerando este aspecto, o principal objetivo do trabalho foi construir e avaliar um sistema automatizado de baixo custo com detecção fluorimétrica, empregando-se um LED (máximo de emissão em 535 nm) para monitorar a degradação do BE. Este instrumento é controlado por microcontroladores (PIC 16F877A e PIC 16F628) que são responsáveis pelos controles dos processos de fluxo das amostras e do fluido carreador e por adquirir e processar o sinal do sistema de detecção, composto de dois fotodiodos e como filtros para, emissão do BE, foram utilizados plásticos de coloração alaranjada. O Fluorímetro proposto foi avaliado tanto em batelada quanto em um sistema de fluxo e apresentou limites de detecção de 0,33 mg L-1 no sistema de fluxo com abordagem stoped-flow e 0,04 mg L-1 em batelada (utilizando cubeta). As medidas realizadas com o instrumento foram comparadas ao de um fluorímetro comercial de bancada e em todas as comparações não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95% de confiança. Foram realizados testes para verificar se o sistema de decisão do instrumento proposto era confiável para indicar automaticamente o final da degradação sendo observada uma taxa de 100% de acerto para as amostras testadas com concentrações acima do limite máximo permitido e abaixo deste limite (5 mg L-1). Alternativamente, avaliou-se a possibilidade de uso de um sistema de detecção de BE utilizando um LED como fonte de excitação e medidas das componentes RGB de imagens a partir de um aplicativo e da câmera de um aparelho celular. Para esta abordagem foi encontrado um limite de detecção de 0,91 mg L-1 utilizando apenas componente R. Comparando-se os resultados obtidos para amostras fortificadas com BE realizadas com o fluorímetro proposto e com a detecção via celular com os resultados obtidos com um espectrofluorímetro comercial, não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95 % de confiança. O Fluorímetro de LED proposto se mostrou eficiente e teve um rendimento satisfatório a um baixo custo (cerca de US$ 200) podendo ser aplicado para a detecção de BE no procedimento de descarte ou na detecção destes em amostras residuais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Ethidium Bromide (BE) is a fluorescent compound which has a significant enhancement of quantum yield when intercalated with RNA and DNA molecules and, due to such effect, it is applied for detection of these species in gel electrophoresis. For that reason, BE is considered dangerous, producing damages to human genetic material and classified as a mutagenic/toxic agent. In order to discard BE residues, is necessary a prior process to turn the substance inert and one of the most applied protocols is the proposed by Lunn and Sansone, where hipofosforic acid and sodium nitrite are used to oxidize the BE. However, this reaction requires a long time period and its finalization must be attested by fluorescence measurements. Considering this, the main objective of this work was to fabricate and evaluate a low cost automated system with fluorometric detection, using a LED (maximum emission in 535 nm) to to monitor BE degradation. The proposed instrument is controlled by microcontrollers (PIC 16F877A and PIC 16F628) that controls the sample and carrier flows and performs the acquisition and processing of the analytical signal from the detector, comprising two photodiodes covered by two pieces of transparent orange plastic. The proposed fluorometer was tested with the use of batch or flow based strategies. Using a stopped-flow system, the limit of detection of 0.33 mg L-1 was achieved and for the batch determination the detection limit was 0.04 mg L-1. The determinations performed with the proposed LED fluorometer were compared to the determinations performed with a commercial spectrofluorometer with no significant differences at 95 % confidence level. Tests were also conducted to verify if the decision system of the proposed instrument was reliable to automatically indicate the end of degradation, being checked 100 % of accuracy for the tested samples with BE concentrations beyond and below the limit of concentration of 5 mg L-1. Alternatively, the detection of BE using a green LED as excitation source and measurements of RGB pattern from photographic images acquired by a cell phone was evaluated. For this approach, the detection limit of 0.91 mg L-1 was stimated using only the Red component of RGB. By comparing the results acquired with the proposed fluorometer/cell phone detection with the data obtained with a commercial spectrofluorometer for BE fortified samples, no significant differences were observed at the 95 % confidence level. The proposed LED Fluorometer was efficient and had a satisfactory performance at a low cost (US$ 200) and can be applied to the detection of BE in the disposal procedure or detecting in residual samples.