Improvement of the yeast slide culture technique

Este trabalho tem como objetivo melhorar a técnica de cultura em lâmina para ser usada na avaliação da viabilidade de leveduras sob diferentes condições fisiológicas. Inicialmente, foram otimizadas as condições ideais para o cultivo em lâmina de uma estirpe laboratorial (BY4741) e de uma estirpe industrial (NCYC 1214) da levedura Saccharomyces cerevisiae. O melhor protocolo foi obtido utilizando: YEPD agar com uma espessura de cerca de 2 mm; 20 μL de uma suspensão de 1 x 105 células/mL para a estirpe BY4741 ou de 5 x 104 células/mL para a estirpe NCYC 1214; uma câmara de humedecimento com 100 μL de água desionizada e um tempo de incubação de 24 h, a 25 ° C. Com o objetivo de facilitar a contagem das microcolónias, foi adicionado um corante (calcofluor white, CFW) ao meio YEPD agar. Ensaios preliminares, em YEPD líquido, contendo diferentes concentrações de CFW, permitiram verificar que o corante, até 5,0 μg/L, não inibe o crescimento da levedura. Uma concentração de 2,5 μg/L de CFW permitiu a coloração da parede das leveduras, não se observando células com morfologia alterada, sendo esta a concentração de CFW selecionado nos estudos subsequentes. A técnica de cultura em lâmina, com ou sem CFW, foi aplicada para avaliar a viabilidade de células saudáveis (células em fase exponencial de crescimento), células submetidas a stress de etanol [células expostas a 20% (v/v) de etanol, a 25 ºC, durante 2 h] e células envelhecidas (células incubadas em água, a 25 ° C, durante 48 h), da estirpe laboratorial. A percentagem de células viáveis não foi significativamente diferente entre as duas técnicas (com ou sem CFW), após uma incubação de 24 horas. Finalmente, a técnica de cultura de lâmina, contendo CFW, foi comparada com duas técnicas habitualmente usadas na indústria cervejeira: fermentação de curta duração e determinação da percentagem de células gemuladas. Os resultados obtidos através da técnica de cultura de lâmina, desenvolvida, seguem um padrão similar aos obtidos nos ensaios de fermentação de curta duração e aos da determinação da percentagem de células gemuladas. Os resultados obtidos sugerem que a técnica de cultura em lâmina, combinada com CFW, parece ser uma alternativa, fácil, rápida (em 24 h) e reprodutível, relativamente ao método convencional (técnica de plaqueamento), para a avaliação da viabilidade de células de levedura. Deverá ser realizado trabalho adicional a fim de validar o método com estirpes industriais.

This work aims to improve the slide culture technique for applying on the evaluation of yeast viability under different physiological conditions. Firstly, the optimal conditions for slide culture were standardized for a laboratorial (BY4741) and an industrial strain (NCYC 1214) of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The best protocol was achieved applying: YEPD agar with a layer thickness of approximately 2 mm; 20 μL of a suspension of 1 x 105 cells/mL for the strain BY4741 or 5 x 104 cells/mL for the strain NCYC 1214; a wetting chamber with 100 μl of deionized water; and an incubation time of 24 h, at 25 °C. With the objective to facilitate the micro colonies counting, a dye (calcofluor white, CFW) was added to YEPD agar. Preliminary experiences in YEPD broth containing different CFW concentrations allowed to verify that the dye did not inhibited the grow up to 5.0 μg/L. As 2.5 μg/L CFW allowed the staining of the yeast cell wall, and no cells with aberrant morphology were observed, it was the CFW concentration selected for further studies. The slide culture technique developed, with or without CFW, was applied to evaluate the viability of healthy cells (cells in exponential phase of growth), ethanol stressed cells [cells exposed to 20 % (v/v) ethanol, at 25 ºC, for 2 h] and aged cells (cells incubated in water, at 25 ºC, for 48 h) of the laboratory strain. The percentage of viability did not differ significantly for both techniques (with or without CFW) tested after 24 h of incubation. Finally slide culture combined with CFW was validated by comparing with the short fermentation and budding assays, two common techniques used in brewing industries. The percentage of viability obtained with the developed technique was in accordance to the short fermentation assay and in some extent to the budding index. The results obtained suggest that the slide culture technique combined with CFW seems to be an easy, fast (within 24h), reproducible and reliable alternative to conventional method (standard plate count technique) for the assessment of viability of yeast cells. More work should be carried out in order to validate the method with industrial strains.