Caracterização genotípica de doentes portugueses com patologias associadas ao complexo multienzimático lisossomal: sialidose e galactosialidose

Dissertação de mestrado em Biologi apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2008

Introdução: Na célula, a actividade funcional das enzimas lisossomais sialidase, beta-galactosidase e N-acetilaminogalacto-6-sulfatase, depende da sua associação com a catepsina A para formar o complexo multienzimático lisossomal. Mutações genéticas em qualquer um dos componentes deste complexo levam a uma deficiência funcional que pode estar na base do aparecimento de uma doença de sobrecarga lisossomal. Neste trabalho estudaram-se os defeitos moleculares causais das doenças sialidose (mutações no gene que codifica a sialidase, NEU1) e galactosialidose (mutações no gene que codifica a catepsina A, PPGB) na população portuguesa. Métodos: A amostra analisada incluiu sete doentes portugueses, três com sialidose e quatro com galactosialidose cujo diagnóstico clínico tinha sido bioquimicamente confirmado. Utilizando DNA genómico, extraído de fibroblastos dos doentes, efectuou-se o estudo molecular dos genes PPGB e NEU1. Em alguns doentes foi também efectuada uma análise ao cDNA. Em todos os doentes analisados os níveis de mRNA foram determinadas por qtRT-PCR a tempo real. O impacto das novas mutações missense foi avaliado ao nível da função e da estrutura tridimensional de cada uma das proteínas através de programas bioinformáticos apropriados (Polyphen, SIFT, PyMOL e Swiss-pdbViewer). Resultados: No gene NEU1, foram identificadas quatro novas mutações, três delas missense (p.P153L, p.D187N, p.Q235H) e uma nonsense (p.R341X). Nos três doentes com galactosialidose, foram detectados quatro alelos diferentes no gene PPGB: duas mutações missense, uma nova (p.G57V) e uma já descrita (p.V104M) e duas novas delecções (c.228-229delC e c.991-992delT). Os estudos de expressão dos genes PPGB e NEU1 por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA na presença de algumas mutações (mRNA PPGB: p.G57V e c.991-992delT; mRNA NEU1: p.Q235H). No que se refere às novas mutações, as previsões do potencial deletério apresentadas pelos softwares Polyphen e SIFT foram unânimes a indicar um carácter patogénico para cada uma delas. De igual modo, quando as consequências das mesmas alterações foram avaliadas através de estudos tridimensionais, obtiveram-se dados que vieram confirmar e reforçar as previsões dos meios bioinformáticos, sobre o seu carácter deletério. Essas previsões foram, então, confrontadas com o fenótipo clínico de todos os doentes a que tivemos acesso. Foi possível, mais uma vez confirmar todas as previsões, estabelecendo uma correlação genótipo-fenótipo bastante coesa, uma vez que, as mutações que se previam mais deletérias, foram detectadas nos doentes com as formas mais graves de cada uma das patologias. Conclusões: Neste estudo foram caracterizados três casos de sialidose e quatro casos de galactosialidose. Como resultado, identificaram-se oito mutações diferentes. Dessas mutações, 7 foram descritas pela primeira vez: P153L, D187N e Q235H no gene NEU1 e G57V, V104M, c.228-229delC e c.991.992delT no gene PPGB. Foram efectuados estudos tridimensionais para todas as novas mutações e os resultados obtidos vieram confirmar e reforçar as previsões que já haviam sido obtidas utilizando os softwares Polyphen e SIFT, sobre o potencial efeito de cada uma delas. Finalmente, as estratégias desenvolvidas para análise mutacional são importantes ferramentas que permitirão a detecção de portadores e o diagnóstico molecular pré-natal, levando a uma melhoria do aconselhamento genético, o que traz grandes benefícios para as famílias afectadas. Estes conhecimentos são ainda importantes para uma melhor compreensão da genética do complexo multienzimático lisossomal.

Backgroung/ Objectives: The functional activity of lysosomal enzymes sialidase, β-galactosidase, and N-acetylaminogalacto-6- sulfate in the cell depends on their association in a multienzyme complex with lysosomal carboxipeptidase, cathepsin A. Genetic mutations in any of this complex components result in their functional deficiency causing severe lysosomal storage disorders. Here we studied the molecular defects underlying sialidosis (mutations in sialidase; gene NEU1) and galactosialidosis (mutations in cathepsin A; gene PPGB) in the Portuguese population. Methods: Our sample included seven Portuguese patients, three affected with sialidosis and four with galactosialidosis whose clinical diagnosis had already been confirmed. Using gDNA extracted from patient’s fibroblasts, we performed a molecular study of the PPGB and NEU1 genes. In some patients a cDNA analysis was also performed. The expression of both genes was determined by qRT-PCR. PolyPhen and SIFT programs were used to predict the significance of missense alterations in protein function. The three-dimensional effect of all the new missense mutations in each protein was also addressed. Generation of protein plots was performed using PyMOL and Swiss-pdbViewer. Results: In the NEU1 gene, we found three novel missense mutations (p.P153L, p.D187N and p.Q235H) and one nonsense mutation (p.R341X). The four galactosialidosis patients harboured four different alleles in the PPGB gene: two missense mutations, one novel (p.G57V) and one previously reported (p.V104M) and two new deletions (c.228- 229delC and c.991-992delT). Expression studies of both genes, NEU1 and PPGB, through qRT-PCR essays, revealed a significant decrease of mRNA levels in presence of some of these mutations (mRNA PPGB: G57V and c.991-992delT; mRNA NEU1: Q235H). Concerning the novel mutations, predictions on the potential effect yielded by the softwares Polyphen and SIFT clearly pointed to their pathogenic nature. Accordingly, when the consequences of the same mutations were assessed through three-dimensional studies, results confirmed and reinforced the deleterious impact on protein function. When we brought together all the information assessed through these studies, it was possible to foresee the severity of each mutation and the phenotype to which each one of them would be associated. Those forecasts were then faced with the real phenotype of all patients. It was possible to confirm all our predictions and establish a coherent genotype-phenotype correlation. All the mutations we expected to be highly deleterious were found in patients with the most severe forms of each pathology. Conclusions: In this study we were able to identify the causative mutations underlying Sialidosis in three patients and Galactosialidosis in four patients. All affected individuals were of Portuguese origin. Seven novel mutations are here reported for the first time, which contributes to enrich the knowledge on the mutational spectrum of both diseases and, by extension, to understand better the genetics of LMC. The developed strategies for mutation analysis constitute valuable tools that will allow carrier detection and prenatal molecular diagnosis, leading to the improvement of genetic counseling with great benefits for the affected families.