Novas estratégias para entender o sistema de influxo de antibióticos e a resistência antimicrobiana a nível molecular

As fluoroquinolonas são antibióticos que têm um largo espectro de ação contra bactérias, especialmente Gram-negativas. O seu mecanismo de ação assenta na inibição de enzimas responsáveis pela replicação do DNA. Porém, devido ao seu uso indevido, o surgimento de resistência bacteriana a estes antibióticos tem-se tornado um grave problema de saúde pública. Uma vez que os seus alvos de ação se situam no meio intracelular, a redução da permeabilidade da membrana externa de bactérias Gram-negativas constitui um dos mecanismos de resistência mais conhecidos. Esta redução é associada à baixa expressão ou mutações em porinas necessárias para permitir o seu transporte, mais concretamente, da OmpF. Estudos prévios demonstraram que a coordenação de fluoroquinolonas com iões metálicos divalentes e 1,10-fenantrolina (genericamente designados metaloantibióticos) são potenciais candidatos como alternativa às fluoroquinolonas convencionais. Estes metaloantibióticos exibem um efeito antimicrobiano comparável ou superior à fluoroquinolona na forma livre, mas parecem ter uma via de translocação diferente, independente de porinas. Estas diferenças no mecanismo de captura podem ser fundamentais para contornar a resistência bacteriana. De forma a compreender o papel dos lípidos no mecanismo de entrada dos metaloantibióticos, estudou-se a interação e localização dos metaloantibióticos da Ciprofloxacina (2ª geração), da Levofloxacina (3ª geração) e Moxifloxacina (4ª geração) com um modelo de membranas de Escherichia coli desprovido de porinas. Estes estudos foram realizados através de técnicas de espectroscopia de fluorescência, por medições em modo estacionário e resolvida no tempo. Os coeficientes de partição determinados demonstraram uma interação mais elevada dos metaloantibióticos relativamente às respetivas fluoroquinolonas na forma livre, um facto que está diretamente relacionado com as espécies existentes em solução a pH fisiológico. Os estudos de localização mostraram que estes metaloantibióticos devem estar inseridos na membrana bacteriana, confirmando a sua entrada independente de porinas. Este mecanismo de entrada, pela via hidrofóbica, é potenciado por interações eletrostáticas entre as espécies catiónicas de metaloantibiótico que existem a pH 7,4 e os grupos carregados negativamente dos fosfolípidos da membrana. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a via de entrada dos metaloantibióticos e das respetivas fluoroquinolonas deve ser diferente. Os metaloantibióticos são candidatos adequados para a realização de mais testes laboratoriais e uma alternativa promissora para substituir as fluoroquinolonas convencionais, uma vez que parecem ultrapassar um dos principais mecanismos de resistência bacteriana a esta classe de antibióticos.

Fluoroquinolones are antibiotics that have a large spectrum of action against bacteria, especially Gram-negative. Their mechanism of action relies on the inhibition of the enzymes responsible for DNA replication. Unfortunately, due to their misuse, the emergence of antimicrobial resistance to these antibiotics has been one of the biggest problems of public health. The major permeability cellular barrier of Gram-negative bacteria for quinolones is the outer membrane. To access their target site, quinolones have to overcome this barrier and the reduction of the membrane permeability is a well-known mechanism of resistance. This reduction is associated to the down-regulation or mutations in porins. Some fluoroquinolones require porins to enter the bacterial cell, mainly OmpF. Previous studies have shown that the coordination of fluoroquinolones to divalent metal ions and 1,10-phenanthroline (known as metalloantibiotics) have potential as antimicrobial agent candidates to replace the conventional fluoroquinolones. These metalloantibiotics exhibit an antimicrobial action comparable or higher than that of fluoroquinolones. Furthermore, their route of translocation is different. This different uptake mechanism can be paramount in counteracting bacterial resistance. In view of the lipids role in bacterial metalloantibiotics uptake, the interaction and the location of Ciprofloxacin (2nd generation), Levofloxacin (3rd generation) and Moxifloxacin (4th generation) metalloantibiotics with Escherichia coli model membrane (without porins) were studied. These studies were performed by fluorescence spectroscopy, using time-resolved and steady-state measures. Partition coefficients determined showed that the interaction is higher for the metalloantibiotics than free fluoroquinolones, which reflects the metalloantibiotics species that are present in solution at physiological pH. Location studies showed that these metalloantibiotics must be located inside the bacterial membrane, confirming their entrance by a porin independent route. This mechanism of metalloantibiotics entry into the bacteria, by the hydrophobic pathway, is strongly dependent of electrostatic interactions. The cationic metalloantibiotics species that exist at pH 7.4 promotes electrostatic interactions with the negatively charged head groups of the membrane lipids. The results obtained in this work suggest that there is a different translocation route for the metalloantibiotics and its respective free fluoroquinolone. Additionally, metalloantibiotics are suitable candidates for more advanced laboratorial testing and also a promising route to bypass resistance mechanisms to fluoroquinolones.

Mestrado em Bioquímica