Avaliação da técnica imunohistoquímica como método de deteção da apoptose a nível celular

A apoptose constitui um processo fisiológico de morte celular, caracterizado por alterações morfológicas distintas e mecanismos bioquímicos e moleculares bem definidos. O seu papel de destaque em numerosos eventos biológicos e importantes processos patológicos conduziu a um crescente interesse na investigação dos mecanismos celulares que regulam o processo apoptótico. A aplicação de metodologias capazes de identificar células apoptóticas despoletou um enorme desenvolvimento de técnicas. No entanto, as propriedades demonstradas por estes ensaios nem sempre se aplicam ao estudo de amostras tecidulares, pelo que a escolha dos diferentes métodos deverá ser criteriosamente avaliada, tendo em conta a aplicação pretendida e as alterações morfológicas que se pretendem detetar. Das várias técnicas disponíveis para deteção da apoptose em tecidos, muitos investigadores recomendam o método TUNEL, o qual se baseia na marcação de produtos endonucleossómicos resultantes da fragmentação do DNA. Outros métodos histoquímicos também disponíveis incluem a deteção do citocromo c, libertado da mitocôndria ou a deteção das proteínas pró e anti-apoptóticas, Bax, Bidm e Bcl-2, envolvidas nos mecanismos intrínsecos da apoptose. Mais recentemente, a marcação de produtos específicos resultantes da clivagem de proteínas alvo pelas caspases, tem vindo a ser considerada uma abordagem promissora. Como principal objectivo deste trabalho pretendeu-se avaliar a técnica imunohistoquímica como método de deteção da apoptose a nível celular, em tecidos animais, tendo por base o método TUNEL, o qual permite a deteção de fragmentos de DNA. Os resultados obtidos permitiram concluir que, apesar do método TUNEL possuir as suas limitações ao nível da sensibilidade e especificidade, o mesmo constitui um mecanismo imunohistoquímico útil na deteção de células apoptóticas. Contudo, segundo opinião de vários autores, adverte-se para a necessidade da aplicação de pelo menos dois métodos imunohistoquímicos como forma de validar a ocorrência do processo apoptótico, razão pela qual se optou pela deteção do citocromo c citosólico como método complementar, uma vez que a sua libertação para o espaço citosólico se encontra implicada na ativação da apoptose.

ABSTRACT: Apoptosis is a physiological cell death process characterized by distinctive morphological changes and biochemical and molecular mechanisms well defined. His leading role in many important biological events and pathological processes has led to a growing interest in investigating the cellular mechanisms that regulate the apoptotic process. The application of methodologies, capable of identifying apoptotic cells, triggered a huge development of techniques. However, the properties shown by these assays do not always apply to the study of tissue samples, whereby the choice of different methods must be carefully evaluated, taking into account the intended application and the morphological changes that are intended to detect. Of the various available techniques for detection of apoptosis in tissues, many investigators recommend the TUNEL method, which is based on the labeling of endonucleossomic products resulting from DNA fragmentation. Other methods available include histochemical detection of cytochrome c release from mitochondria or detection of proteins pro-and anti-apoptotic Bax, Bid and Bcl-2, involved in the intrinsic mechanisms of apoptosis. More recently, the marking of specific products resulting from cleavage by caspases target proteins, has been regarded as a promising approach. The main objective of this work intended to evaluate the immunohistochemical technique as a method for detection of apoptosis at cellular level, in animal tissues, based on TUNEL method, which allows the detection of DNA fragments. The results showed that, despite the TUNEL method has its limitations in terms of sensitivity and specificity, it constitutes a mechanism useful for immunohistochemical detection of apoptotic cells. However, according to the opinion of several authors, attention is drawn to the need to apply, at least, two immuhistochemical methods as a way to validate the occurrence of apoptosis, so, for that reason, we opted for the detection of cytosolic cytochrome c as a complementary method, since their release into the cytosolic space is implicated in the activation of apoptosis.