Clonagem molecular, expressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas.

The increase in global energy demand, shrinkage perspective of energy resources and global concern about environmental issues, aroused interest in finding alternative sources of energy. Lignocellulosic biomass is plentiful and inexpensive, and has the potential to complement the large-scale production of fuel. The degradation of molecules that constitute the cell wall to fermentable sugars and then to ethanol, occurs via the enzymatic hydrolysis of biomass. However, the use of enzymes for this purpose is in exploratory stage and represents a bottleneck in the implementation of 2G ethanol technologies in industrial scale, supporting studies about biochemically most active, stable and economically viable cellulases. This work aimed the characterization of endoglucanase I from fungus Trichoderma harzianum and for that, was performed expression and biochemical and biophysical assays of the catalytic domain (ThCel7B-CCD) and full protein (ThCel7B-full). The enzyme exhibited a acidophilic profile, with optimal activity at pH 3.0 at 55°C. The protein was also able to hydrolyze a variety of substrates, with higher hydrolytic activity in β-glucano (75 U mg-1). Analyzing the thermal stability as pH 5, residual activity remained intact for over 2 months. Another important feature was the high degree of synergy between ThCel7B and ThCel7A (DS 3). Electron microscopy analysis of oat samples subjected to hydrolysis with ThCel7B show the substrate degradation effects in relation to the control samples. All these results, as well as important for understanding the molecular mechanism of ThCel7B and other endoglucanases of GH7 family, also disclose an enzyme of biotechnological interest because the acid behavior and thermal stability are promises of industrial applications under extremely acidic conditions.