Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo-biloba-Extraktes EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

Der Ginkgo biloba-Extrakt EGb 761 besteht aus einer Reihe pharmakologisch wirksamer Substanzen, welche gut beschriebene Wirkungen auf verschiedene potentiell zytoprotektive Signalwege ausüben und u.a. antioxidative Wirksamkeit haben. Folglich wurde EGb 761 bisher als eine natürliche Behandlung bei neurodegenerativen Erkrankungen mit zellulärem oxidativen Stress angewendet, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD). Aufgrund von vielen gemeinsamen Merkmalen zwischen der AD und der Huntington-Krankheit (HD) wurde vermutet, dass EGb 761 eventuell auch positive Wirksamkeit bei der HD aufweisen könnte. rnDie Neuropathologie der HD wird durch pathologische Verlängerung an Glutamin-Wiederholungen im Huntingtin-Protein (polyQ-Protein) verursacht, wodurch es zu Fehlfaltungen im Protein kommt und hierdurch der proteasomale Abbau aberranter Proteine erschwert wird. Somit sollten in der vorliegenden Arbeit die EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität und die Proteinaggregation in zellulären Modellen der HD untersucht werden. rnWie die ersten Untersuchungen in nativen HEK293-Zellen ergaben, bewirkte die Behandlung der Zellen mit EGb 761 eine Steigerung der basalen Proteasom-Aktivität sowie des proteasomalen Proteinabbaus und erhöhte die Transkription proteasomaler Gene. Hieraus ergaben sich Untersuchungen in Zellen mit Expressionen pathologischer Varianten von polyQ-Proteinen als zelluläre Modelle der HD. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteine eine verminderte zelluläre Proteasom-Aktivität bewirkte. Interessanterweise verursachte EGb 761 eine Abmilderung der pathologisch-induzierten verminderten Proteasom-Aktivität, in dem die EGb 761-Behandlung der Zellen zu einer erhöhten Proteasom-Aktivität, einem verbesserten proteasomalen Proteinabbau, sowie zu einer erhöhten Transkription proteasomaler Gene führte. Da diese EGb 761-Effekte unabhängig von der Expression aberranter polyQ-Proteine waren, demonstrierten diese Ergebnisse eine allgemeine EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse sollten anschließend weitere Untersuchungen mit zellulären Modellen der HD die genau Wirkung von EGb 761 auf die Degradation von abnormal verlängerten polyQ-Proteinen sowie auf die Bildung von polyQ-Aggregaten klären. rnHier konnte gezeigt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteinen zu einer Akkumulation von SDS-resistenten bzw. SDS-unlöslichen, aggregierten polyQ-Proteinen führte, sowie die Bildung von sichtbaren polyQ-Aggregaten in Zellen bewirkte. Hierbei verursachte eine EGb 761-Behandlung der Zellen eine signifikante Verminderung im Gehalt an SDS-resistenten polyQ-Proteinen sowie eine Reduzierung von Aggregat-tragenden Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Inhibition des Proteasoms in EGb 761-behandelten Zellen, den Gehalt an SDS-unlöslichen polyQ-Proteinaggregate wieder erhöhte und somit den Effekt von EGb 761 aufhob. Folglich zeigten diese Ergebnisse, dass die EGb 761-induzierte Reduzierung der polyQ-Proteinaggregate durch einen effizienteren proteasomalen Abbau von fehlgefalteten, aberranten polyQ-Proteinen bewirkte wurde. rnAufbauend auf diesen Ergebnissen wurde eine experimentell-therapeutische Anwendung von EGb 761 in Modellen der HD in vitro und in vivo überprüft und hierzu primäre humane Fibroblasten sowie transgene C. elegans Würmer mit Expressionen aberranter polyQ-Proteine untersucht. Interessanterweise konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die EGb 761-Behandlung auch hier eine Reduzierung von SDS-unlöslichen polyQ-Proteinen bewirkte und zudem eine Reduzierung des pathologisch erhöhten Gehalts an Polyubiquitin-Proteinen bewirkte. Folglich wurde auch hier vermutet, dass EGb 761 einen verbesserten proteasomalen Abbau von polyQ-Proteinen induzierte und dies eine Verminderung der polyQ-Proteinaggregate verursachte. Darüber hinaus führte die EGb 761-Behandlung von seneszenten Fibroblasten zur Reduzierung von altersabhängig erhöhten Mengen von polyQ-Aggregaten, wodurch ein therapeutischer Effekt auf den proteasomalen Abbau der polyQ-Proteine verdeutlicht wurde. Zusätzlich konnte in polyQ-transgenen C. elegans demonstriert werden, dass eine EGb 761-Behandlung die Abmilderung eines typischen pathologischen Phänotyps bewirkte, indem eine polyQ-induzierte verminderte Motilität der Nematoden verbessert wurde und hierdurch eine positive EGb 761-Wirkung auf die Pathologie der HD in vivo dargestellt wurde. rnZusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Wirkungen von EGb 761 in der HD demonstriert werden. Hierbei wurde gezeigt, dass EGb 761 die Aggregation von pathogenen aberranten polyQ-Proteinen in vitro und in vivo reduziert, indem eine effizientere Degradation von polyQ-Proteinen erfolgt. Somit könnte diese Wirkungen von EGb 761 eine potentiell therapeutische Anwendung in der HD und ähnliche neurodegenerativen Erkrankungen darstellen.

The Ginkgo biloba extract EGb 761 is a multifaceted composition of pharmacological effective substances, with well-described effects on different cytoprotective signaling pathways and antioxidative activities. Consequently, EGb 761 has been used as a natural treatment for a variety of disorders associated with cellular oxidative stress, as well as in the neurodegenerative Alzheimer’s disease (AD). Based on many common hallmarks between AD and Huntington’s disease (HD), it was suggested that EGb 761 could also have beneficial effects in HD. The neuropathology of HD is caused by pathological expansions repeats of glutamines in the huntingtin protein (polyQ protein), leading to misfolding of the protein and hereby exacerbating the proteasomal degradation of the aberrant protein. Thus, degradation of the misfolded protein is reduced, resulting in an accumulation and aggregation of these proteins, finally yielding in SDS-resistant protein aggregates. Therefore, the aim of this study was to investigate the properties of EGb 761 on proteasome activity and protein aggregation, in cellular models of HD. rnThe first conducted experiments in native HEK293 cells revealed that the treatment with EGb 761 increased the basal proteasome activity, enhanced protein degradation and induced a higher transcription of proteasome genes. As a consequence, further experiments were performed in cells expressing pathologic variants of polyQ proteins, as cellular models of HD. Thus, it was demonstrated that the expression of aberrant polyQ proteins resulted in a reduced proteasome activity. Interestingly, EGb 761 attenuated the pathologic decrease of proteasome activity by an induced increase of proteasome activity, enhanced proteasomal protein degradation and an elevated transcription of proteasome genes. Hence, as these effects of EGb 761 occurred in all cells despite their expression of polyQ proteins, these results indicated a ubiquitous impact of EGb 761 on proteasome activity. Therefore, a mechanism for the activity of EGb 761 was proposed, in which EGb 761 activated the NRF2-KEAP1 pathway and thereby inducing the transcription of catalytic proteasome genes, resulting in a higher proteasome activity. Based on these findings, further experiments were conducted in cellular models of HD to clarify the effects of EGb 761 on the degradation of aberrant expanded polyQ proteins and the formation of polyQ aggregates.rnConsequently, the performed experiments demonstrated that the expression of aberrant polyQ proteins resulted in the accumulation of SDS-resistant or SDS-insoluble aggregated polyQ proteins and caused the formation of visible polyQ aggregates in cells. Thus, the treatment of cells with EGb 761 induced significantly lower levels of SDS-insoluble polyQ proteins and a reduced the amount of cells bearing polyQ aggregates. Hence, it was shown that a pharmacological proteasome inhibition of EGb 761 treated cells led to an increase of SDS-insoluble aggregated polyQ proteins, thereby abolishing the effect of EGb 761. Therefore theses data showed that EGb 761 induced reduction of polyQ protein aggregates was mediated through a more efficient proteasomal degradation of misfolded aberrant polyQ proteins.rnIn addition, a potential therapeutic usage of EGb 761 in HD was tested in vitro and in vivo, by investigating human fibroblasts, as well as transgenic C. elegans, expressing aberrant polyQ proteins. Interestingly, it was shown in vitro and in vivo that the EGb 761-treatment was also effective in reducing SDS-insoluble polyQ proteins, in the alleviation of visible polyQ aggregates and in reducing pathologic elevated levels of polyubiquitin proteins. Thus, it was presumed that EGb 761 induced an enhanced proteasomal degradation of polyQ proteins thereby reducing polyQ aggregates. Moreover, the EGb 761-treatment of senescent fibroblasts reduced age-dependent elevated amounts of polyQ aggregates, revealing a therapeutic effect on the proteasomal degradation of polyQ proteins. Furthermore, the treatment with EGb 761 ameliorated a pathologic phenotype in transgenic C. elegans through enhancing a reduced motility of the nematodes, showing a beneficial effect of EGb 761 on the HD pathology in vivo. rnIn summary, this study demonstrated new effects of EGb 761 in HD. Hence, it was shown that EGb 761 reduces the aggregation of pathogenic aberrant polyQ proteins in vitro and in vivo, by enhancing the proteasomal degradation of polyQ proteins. Conclusively, these effects of EGb 761 could have a therapeutic relevance in HD and similar neurodegenerative diseases.