Charakterisierung der Proteine CEP164 und ppdpf sowie deren Einordnung in den mitotischen Kontext

Eine regelgerechte bipolare Mitose und die fehlerfreie Aufteilung duplizierter DNA ist die Voraussetzung für die Entwicklung aller Lebewesen. Treten Fehler bei diesem grundsätzlichen Prozess auf, ist entweder der Zelltod oder die maligne Entartung der Zelle die Folge. Daher ist es von zentraler Bedeutung, die Vorgänge während der Zellteilung zu verstehen und die Funktion der an diesem Prozess beteiligten Proteine aufzudecken. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden im Rahmen eines siRNA-Screens genomweit alle Proteine durch RNA-Interferenz depletiert und die Mitosen nach erfolgter RNAi phänotypisch untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Entwicklung multipolarer Spindeln durch Defekte in der Zentrosomenbündelung. Dadurch wurden unter anderem die Proteine CEP164 und ppdpf identifiziert. Da weder für CEP164 noch für ppdpf mitotische Funktionen bekannt sind, war es Ziel dieser Arbeit, die beiden Proteine eingehender zu charakterisieren und in den Kontext der Mitose einzuordnen. rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CEP164 einer komplexen mitotischen Regulation unterliegt. Die in Interphase durchweg zentrosomale Lokalisation von CEP164 geht in der Mitose verloren. Es wird demonstriert, dass CEP164 während der Mitose unter anderem von CDK1 phosphoryliert wird und des Weiteren ubiquitinyliert wird. Als Interaktionspartner wurde das zentrosomale Protein Ninein identifiziert und demonstriert, dass sich CEP164 mit diesem in einem Komplex von ~2MDA befindet. Als weiterer Interaktionspartner wurde das Ninein-like-Protein ermittelt. Im Hinblick auf die Induktion multipolarer Mitosen wurde gezeigt, dass die Depletion von CEP164 nicht dafür verantwortlich ist. Die Induktion multipolarer Spindeln ist stattdessen darin begründet, dass durch die Transfektion einer siRNA gegen CEP164 auch ein für die Ausbildung der mitotischen Spindel elementares Protein, Ch-TOG, depletiert wird.rnIm Gegensatz dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt, dass das Protein ppdpf eine wichtige mitotische Funktion übernimmt. Zwar führt die Depletion von ppdpf nur zu einer sehr geringen Zunahme multipolarer Mitosen, allerdings steigt die Zahl aberranter Mitosen deutlich an, während die Spannung innerhalb mitotischer Spindeln abnimmt. Desweiteren konnte nachgewiesen werde, dass ppdpf-RNAi die Entwicklung von „lagging chromosomes“ und nachfolgend von Mikrokernen begünstigt. Es wurde gezeigt, dass ppdpf während der Mitose an Spindelmikrotubuli lokalisiert und spezifisch acetyliertes Tubulin bindet. Diese Interaktion hatte allerdings keinen Einfluss auf die Stabilität von Mikrotubuli während der Mitose. Das Protein ppdpf interagiert zudem mit dem Kinesin Eg5, wobei ppdpf-RNAi allerdings nicht zu einer Modulation der Aktivität von Eg5 zu führen scheint. Inwiefern diese Eigenschaften die Entwicklung von „lagging chromosomes“ begünstigen ist derzeit noch offen.

The faithful segregation of chromosomes is elementary for the existence of life. Errors in this process either lead to cell death or may increase the risc of tumorigenic transformation. Hence, it is of utmost importance to delineate the functions of proteins during this fundamental process. In preparation of this work a genome-wide siRNA screen has been conducted with the aim of identifying proteins with an influence on centrosomal clustering. This work led to the identification of the proteins CEP164 and ppdpf as being neccessary for a regular mitosis. Since no mitotic function has so far been ascribed to either CEP164 or ppdpf, this work aims at characterizing these two proteins and elucidating their mitotic functions.rnHere it is demonstrated that CEP164 is subject to a complex mitotic regulation. The protein itself is extensively modified and the centrosomal localisation of CEP164 is lost at the onset of mitosis. The posttranslational modifications include phosphorylation by CDK1 and ubiquitinylation. In this work it has been shown that CEP164 interacts with another centrosomal protein, Ninein, and is part of a ~2MDa complex. Furthermore, CEP164 also interacts with the protein Ninein-like-Protein. Unfortunately, the induction of multipolar mitosis cannot be attributed to the depletion of CEP164. Instead it can be demonstrated that an off-target effect of the siRNA used strongly diminishes the levels of a crucial factor for bipolar spindle assembly, namely Ch-TOG.rnWith regard to ppdpf it is shown that although it does not seem to be essential for bipolar spindle assembly, ppdpf does have an important role for the accurate segregation of chromosomes during mitosis. Upon depletion of ppdpf the amount of lagging chromosomes and consequently, micronuclei increase, accompanied by a loss of spindletension. Depletion of ppdpf though, has no effect on microtubule-stability during mitosis. Furthermore, endogeneous ppdpf exclusively localizes to mitotic spindles during mitosis and an interaction with acetylated tubulin is demonstrated along with an interaction with the kinesin Eg5. How these functions lead to the development of lagging chromosomes upon depletion of ppdpf however remains obscure, but modulation of Eg5 activity can be excluded.