Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn

Differently substituted reagents, based on the coumarin scaffold, were examined and structure-function relationship studies revealed selectivity for a naturally occurring modified nucleoside, namely 4-thiouridine (s4U). These studies were mainly done by LC-MS/MS analysis of the coumarin products in tRNA samples. The multifunctional coumarin, named PBC with 2000 fold selectivity for s4U over uridine was found. PBC can be used for the bioorthogonal CuAAC reaction and was used for fluorescent labeling of small interfering RNA followed by successful cellular transfection.rnIn addition another, coumarin-based reagent, termed N3BC, has the advantage of: (I) being applicable post-transcriptionally to all kinds of RNAs, (II) displaying fluorescence and (III) having a further functional group for further bioconjugate reactions. The latter comprise, e.g. UV triggered crosslinking experiments with cognate proteins, as well as the CuAAC reaction with fluorescent alkyne-dyes. rnOver 100 other modified nucleosides are described in the literature, most of them being undetectable by small molecules. The differential physicochemical properties of modified nucleosides were exploited and several LC-MS/MS methods for identification and quantification of up to 21 modified ribonucleosides and 5 deoxyribonucleosides in a single run, were developed. In addition, these methods were applied to several studies, mostly on RNA:methyltransferases.rn