Specific enzymatic cleavage and payload release from peptide-based hybrid nanocapsules

Within this thesis, new approaches for the concepts of peptide-polymer conjugates and peptide-based hybrid nanomaterials are investigated. In the first part, the synthesis of a triblock polymer-peptide-polymer is carried out following a typical peptide coupling reaction, both in solution and on solid-phase. The peptide sequence is chosen, so that it is cleaved by an enzyme preparation of trypsin. End-functionalized polystyrene is used as a model hydrophobic polymer and coupled to the peptide sequence. The results show successful coupling reactions in both methods, while the solid phase method produced a more defined product. Suspensions, consisting of peptide-polymer conjugates particles, are prepared in water by ultrasonication. In contact with the enzyme, the peptide constituting the conjugated particles is cleaved. This demonstrates the enzymatic cleavage in heterophase of enzymatic sequence bond to hydrophobic polymers, and is of great interest for the encapsulation and delivery of hydrophobic molecules.rnA second approach is the preparation of peptide-based hybrid nanocapsules. This is achieved by interfacial polyaddition in inverse miniemulsion with the peptide sequence functionalized with additional amino acids. A method suitable to the use of a peptide sequence for interfacial polyaddition was developed. It is shown that, the polarity of the dispersed phase influences the structures prepared, from particle-like to polymeric shell with a liquid core.rnThe peptide sequence is equipped with a FRET pair (more exactly, an internally-quenched fluorescent system) which allows the real-time monitoring of the enzymatic cleavage of the recognition site. This system shows the successful cleavage of the peptide-based nanocapsules when trypsin preparation is added to the suspensions. A water-soluble fluorescent polymer is efficiently entrapped and its possible use as marker for the capsules is highlighted. Furthermore, a small water-soluble fluorescent dye (SR-101) is successfully encapsulated and the encapsulation efficiency as a function of the functionality of the peptide and the amount of comonomer equivalent (toluene diisocyanate) is studied. The dye is encapsulated at such a high concentration, that self-quenching occurs. Thus, the release of the encapsulated dye triggered by the enzymatic cleavage of the peptide results in a fluorescence recovery of the dye. The fluorescence recovery of the FRET pair in the peptide and of the encapsulated dye correlate well.rnFinally, nanocapsules based on a hepsin-cleavable peptide sequence are prepared. Hepsin is an enzyme, which is highly upregulated in prostate cancer cells. The cleavage of the nanocapsules is investigated with healthy and “cancerous” (hepsin-expressing) cell cultures. The degradation, followed via fluorescence recovery of the FRET system, is faster for the suspensions introduced in the hepsin expressing cell cultures.rnIn summary, this work tackles the domain of responsive nanomaterials for drug delivery from a new perspective. It presents the adaptation of the miniemulsion process for hybrid peptide-based materials, and their successful use in preparing specific enzyme-responsive nanoparticles, with hydrophilic payload release properties.rn

In dieser Dissertation werden neue Konzepte zu Peptid-Polymer Konjugaten und Peptide-basierten Hybrid Nanomaterialien präsentiert. rnDer erste Teil bezieht sich auf die Synthese eines triblock Polymer-Peptid-Polymer Konjugats, sowohl in Lösung wie auch als Festphasenreaktion, auf Basis einer typischen Peptid Kopplungsreaktion. Die Peptidsequenz ist so gewählt, dass sie durch ein Enzym (Trypsin Präparation) gespalten wird. End-funktionalisiertes Polystyrol wird als hydrophobes Modellpolymer benutzt und an die Peptidsequenz gekoppelt. Die Ergebnisse zeigen mit beiden Methoden erfolgreiche Kopplungsreaktionen, wobei mittels Festphasensynthese ein definierteres Konjugat erhalten wird. Desweiteren werden Konjugat-Partikel Suspensionen in Wasser durch Ultraschallbehandlung von Peptid-Polymer Konjugaten hergestellt. Im Kontakt mit Enzym wird das Peptid der Konjugat-Partikel gespalten. Damit ist die enzymatische Spaltung von Peptidsequenzen, die sich in Heterophase befinden, nachgewiesen. Dies ist sehr interessant für die Verkapselung und Freisetzung von hydrophoben Molekülen.rnEine zweite Methode ist die Synthese von Peptid-basierten Hybrid-Nanokapseln. Dazu wird eine Grenzflächen-Polyaddition in inverser Miniemulsion durchgeführt, wobei die Peptidsequenz mit zusätzlichen Aminosäuren funktionalisiert ist. Es wird gezeigt, dass die Polarität der dispergierten Phase die Morphologie der hergestellten Strukturen beeinflusst. Dabei können Strukturen von Partikeln bis zu Polymerkapseln mit flüssigem Kern synthetisiert werden.rnDie Peptidsequenz wird mit einem FRET-Paar (genauer: interne Fluoreszenzlöschung) ausgestattet, welches die Verfolgung der enzymatische Spaltung in Echtzeit erlaubt. Das System zeigt die erfolgreiche Spaltung der Peptid-basierten Nanokapseln, sobald die Trypsin Präparation zu den Suspensionen hinzugefügt wird. Ein wasserlöslicher, polymerbasierter Fluoreszenzfarbstoff kann effizient verkapselt werden, und seine mögliche Benutzung als Marker für die Kapseln ist hervorgehoben. Zusätzlich wird ein kleiner wasserlöslicher Fluoreszenzfarbstoff (SR-101) in einer Konzentration, in der interne Fluoreszenzlöschung auftritt, erfolgreich verkapselt. Die Verkapselungseffizienz im Verhältnis zur Peptid Funktionalität und Anzahl an Comonomeräquivalenten (Toluol-diisocyanat) wird diskutiert. Die Freisetzung von verkapseltem Farbstoff als Ergebnis der enzymatischern Spaltung, führt zu einem Fluoreszenzanstieg. Dabei kann eine gute Korrelation zwischen dem Fluoreszenzanstieg des FRET Paares und dem eingeschlossenen Farbstoff beobachtet werden.rnDiese Ergebnisse führen zu der Präparation von Nanokapseln, die auf einer hepsin-spaltbaren Peptidsequenz basieren. Hepsin ist ein Enzym, das in Prostata Tumorzellen stark überexprimiert ist. Die Spaltung dieser Nanokapseln wird sowohl mit gesunden als auch mit kanzerogenen (Hepsin-exprimierte) Zellen durchgeführt. Die Degradation der Kapseln, verfolgt durch das oben erwähnte FRET-System, ist im Fall von den Hepsin-exprimierten Zellen schneller.rnDiese Arbeit eröffnet neue Perspektiven im Bereich responsiver Nanomaterialien zur Medikamentenfreisetzung. Sie stellt eine Adaption von Miniemulsionspolymerisationen zu hybriden, peptid-basierten Materialien und deren erfolgreiche Anwendung für die Herstellung von enzym-responsiven Nanopartikeln zur spezifischen Freisetzung wasserlöslicher Moleküle dar.rn