Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

This work was dedicated to the investigation of primary rat and human hepatocyte cell cultures regarding their ability to display species differences in the toxicity and metabolism of xenobiotics and whether these results allow for an in vitro – in vivo-correlation. In addition, a cell culture model was established that allows for the cultivation of primary hepatocytes from rat, human and mouse for a minimum of one to two weeks with preserved liver-like properties.rnrnAfter treatment of primary rat and human hepatocytes with the human hepatotoxicants diclofenac and troglitazone, cultures showed distinct species-specific differences in their gene expression response. Induction of drug metabolizing enzymes and their transcriptional regulators occurred predominantly in human hepatocytes, along with an increased stress reaction.rnDistinct species differences regarding the activity and gene expression of cytochrome P450 enzymes were also observed after treatment of primary rat and human hepatocyte cell cultures with the drug development candidate EMD 392949, once again accompanied by a corresponding reaction of the nuclear receptors regulating their transcription. Moreover, in this study there was a strong correlation between results from primary rat and human hepatocyte cultures in comparison to in vivo experiments in rats and monkeys (Macaca fascicularis) which greatly strengthens the value of the in vitro experiments.rnThe good correlation of enzyme activity and mRNA levels regarding the induction of drug metabolizing enzymes was confirmed using various species specific inducers for the treatment of primary rat and human hepatocyte cultures, especially when evaluating CYP induction according to the FDA’s (Food and Drug Administration) recommendation.rnrnThe differentiation status and durability of primary hepatocytes in culture strongly depends on the applied cell culture conditions. In this work we showed that culturing primary rat hepatocytes between two layers of gelled collagen I under serum-free conditions retained liver-like properties for a minimum of two weeks. Furthermore, this culture model was successfully transferred to primary human and mouse hepatocytes and greatly expands the use of primary hepatocyte cell cultures towards the investigation of subchronic toxicities after repeated long-term treatment and additional analyses.rn