Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen Differenzierungsmarker islet exprimieren.

Neurogenesis and axon pathfinding have been subject to a great deal of scientific projects in various organisms over the last decades and the amounting data in insects and crustaceans give a good overview on how a nervous system is established in arthropods. However, although the developmental processes are well understood in these groups, research in chelicerates and myriapods in a similar direction has been neglected. The main focus of the present work therefore was to uncover the mechanisms involved in axon pathfinding and midline guidance in two representatives of the chelicerates, the spiders Cupiennius salei and Achaearanea tepidariorum. A prerequisite for the detailed analysis of these processes is the knowledge of CNS architecture. Hence, in a first step I described the morphology of the embryonic nervous system throughout embryonic development and was able to show that in spiders essentially a typical arthropod nerve cord is being established. Furthermore, the spider axon scaffold is formed on the basis of segmentally organised neurons of which groups as well as single cells pioneer axonal tracts. Specifically, I could identify an individual neuron, which in position, projection pattern and marker expression is comparable to the RP2 neuron in Drosophila that pioneers the posterior root of the segmental nerve.rnrnIn a second step I analysed the spider ventral midline with respect to its possible function in axonal guidance. It was shown that the ventral midline epithelium, which spans the gap between the germ band halves during the entire process of inversion, is of a transient nature and does not give rise to neural cells. It is thus comparable to the floor plate, which also only exists transiently. The examination of single minded revealed that different to Drosophila, where sim is expressed in midline cells and functions as the key regulatory gene for midline specification, in spiders sim is not expressed in the midline epithelium but adjacent to it and the NE, comparable to vertebrate Sim. Furthermore, I observed sim expression in the bases of the appendages and in the head. Like in vertebrates it might be involved in pattering processes of these tissues. Nevertheless, the midline in spiders functions as an organising centre for outgrowing commissural axons, a function it shares with other invertebrates and vertebrates.rnrnThe signalling network involved in axon pathfinding at the midline is highly conserved across species. In this work I was able to identify one netrin homologue in both Achaearanea and Cupiennius and could provide evidence of a conserved function of the chemotropic guidance factor in commissural axon guidance. In RNAi experiments that down-regulated netrin function the formation of the entire embryonic nerve cord, in particular that of the commissures, was severely affected. Furthermore, I could identify a novel function for netrin which has not yet been described in other organisms. Besides its role in axon pathfinding netrin appears to be involved in epithelial morphogenesis in the central nervous system. In this function netrin appears to be required in glial cells that surround the epithelial vesicles of the NPGs to maintain the undifferentiated state of neural precursors. Depletion of netrin leads to the premature segregation of neural precursor cells from the invagination sites and to an increase of cells that express the early differentiation marker islet.