On the inheritance and mechanism of baculovirus resistance of the codling moth, Cydia pomonella (L.)

Das Cydia pomonella Granulovirus (CpGV, Baculoviridae) wird seit Ende der 1980er Jahre als hoch-selektives und effizientes biologisches Bekämpfungsmittel zur Kontrolle des Apfelwicklers im Obstanbau eingesetzt. Seit 2004 wurden in Europa verschiedene Apfelwicklerpopulationen beobachtet die resistent gegenüber dem hauptsächlich angewendeten Isolat CpGV-M aufweisen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Vererbung und des Mechanismus der CpGV Resistenz. Einzelpaarkreuzungen zwischen einem empfindlichen Laborstamm (CpS) und einem homogen resistenten Stamm (CpRR1) zeigten, dass die Resistenz durch ein einziges dominantes Gen, das auf dem Z-Chromosom lokalisiert ist, vererbt wird. Massernkreuzungen zwischen CpS und einer heterogen resistenten Feldpopulation (CpR) deuteten zunächst auf einen unvollständig dominanten autosomalen Erbgang hin. Einzelpaarkreuzungen zwischen CpS und CpR bewiesen jedoch, dass die Resistenz in CpR ebenfalls monogen dominant und geschlechtsgebunden auf dem Z-Chromosom vererbt wird. Diese Arbeit diskutiert zudem die Vor- und Nachteile von Einzelpaarkreuzungen gegenüber Massernkreuzungen bei der Untersuchung von Vererbungsmechanismen. Die Wirksamkeit eines neuen CpGV Isolates aus dem Iran (CpGV-I12) gegenüber CpRR1 Larven, wurde in Bioassays getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass CpGV-I12 die Resistenz in allen Larvenstadien von CpRR1 brechen kann und fast so gut wirkt wie CpGV-M gegenüber CpS Larven. Daher ist CpGV-I12 für die Kontrolle des Apfelwicklers in Anlagen wo die Resistenz aufgetreten ist geeignet. Um den der CpGV Resistenz zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, wurden vier verschiedene Experimente durchgeführt: 1) die peritrophische Membran degradiert indem ein optischer Aufheller dem virus-enthaltenden Futtermedium beigefügt wurde. Das Entfernen dieser mechanischen Schutzbarriere, die den Mitteldarm auskleidet, führte allerdings nicht zu einer Reduzierung der Resistenz in CpR Larven. Demnach ist die peritrophische Membran nicht am Resistenzmechanismus beteiligt. 2) Die Injektion von Budded Virus in das Hämocoel führte nicht zur Brechung der Resistenz. Folglich die die Resistenz nicht auf den Mitteldarm beschränkt, sondern auch in der Sekundärinfektion wirksam. 3) Die Replikation von CpGV in verschiedenen Geweben (Mitteldarm, Hämolymphe und Fettkörper) von CpS und CpRR1 wurde mittels quantitativer PCR verfolgt. In CpS Larven konnte in allen drei Gewebetypen sowohl nach oraler als auch nach intra-hämocoelarer Infektion eine Zunahme der CpGV Genome in Abhängigkeit der Zeit festgestellt werden. Dagegen konnte in den Geweben aus CpRR1 nach oraler sowie intra-hämocoelarer Infektion keine Virusreplikation detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass die CpGV Resistenz in allen Zelltypen präsent ist. 4) Um zu untersuchen ob ein humoraler Faktor in der Hämolymphe ursächlich an der Resistenz beteiligt ist, wurde Hämolymphe aus CpRR1 Larven in CpS Larven injiziert und diese anschließend oral mit CpGV infiziert. Es konnte jedoch keine Immunreaktion beobachtet und kein Faktor in der Hämolymphe identifiziert werden, der Resistenz induzieren könnte. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann festgestellt werden, dass in resistenten Apfelwicklerlarven die virale Replikation in allen Zelltypen verhindert wird, was auf eine Virus-Zell Inkompatibilität hinweist. Da in CpRR1 keine DNA Replikation beobachtet wurde, wird die CpGV Resistenz wahrscheinlich durch eine frühe Unterbindung der Virusreplikation verursacht.Das früh exprimierte Gen pe38 codiert für ein Protein, das wahrscheinlich für die Resistenzbrechung durch CpGV-I12 verantwortlich ist. Interaktionen zwischen dem Protein PE38 und Proteinen in CpRR1 wurden mit Hilfe des Yeast Two-Hybrid (Y2H) Systems untersucht. Die detektierten Interaktionen sind noch nicht durch andere Methoden bestätigt, jedoch wurden zwei mögliche Gene auf dem Z-Chromosom und eines auf Chromosom 15 gefunden, wie möglicherweise an der CpGV Resistenz beteiligt sind.

The Cydia pomonella granulovirus (CpGV, Baculoviridae) is the most important biocontrol agent of the codling moth in apple production. It is successfully used since the late 1980s, particularly in organinc apple production. Since 2004, several codling moth populations which are resistant to the commonly used isolate CpGV-M have been observed in Europe. This thesis is focused on the analysis of the inheritance and the mechanism of CpGV resistance. Single pair crosses between a susceptible laboratory strain (CpS) and a homogeneous CpGV resistant strain (CpRR1) revealed that CpGV resistance is inherited by a single dominant gene, which is located on the Z-chromosome. Mass crossing experiments between CpS and a heterogeneous resistant, field collected strain (CpR) initially suggested an autosomal incomplete dominant mode of inheritance. However, single pair crosses between CpS and CpR disclosed that CpR and CpRR1 share the same mode of inheritance of CpGV resistance. This thesis also discusses the advantages of single pair crossings compared to mass crossings in terms of elucidating the mode of resistance inheritance. The efficacy of a new CpGV isolate (CpGV-I12) originating from Iran was tested against CpRR1 larvae in bioassays. CpGV-I12 is able to overcome resistance in all larval stages of CpRR1 and works almost as well as CpGV-M against CpS larvae. CpGV-I12 is suitable for codling moth control in orchards where resistance against CpGV-M has occurred. In order to investigate the mechanism underlying CpGV resistance, four different experimental approaches were followed: First, the peritrophic membrane was degraded by adding an optical brightener to the diet containing virus. However, the removal of this mechanical barrier in the midgut did not lead to enhanced CpGV infection in resistant larvae suggesting that the PM is not involved in resistance. Second, injection of CpGV budded virus directly into the insect’s haemocoel did not overcome resistance. Accordingly, CpGV resistance is not restricted to the midgut but also present in secondary infection. Third, CpGV replication was traced by quantitative PCR in three different tissues of susceptible (CpS) and resistant (CpRR1) insects. After both oral and intrahaemocoelar infection, the amount of CpGV copies detected in all three tissue types of CpS increased with time elapsed. Virus replication could not be detected in any of the isolated tissue types of CpRR1. This indicates that CpGV resistance is present in each of the cell types. Fourth, CpGV caused mortality was analysed after transfusion of haemolymph between resistant (CpRR1) and susceptible (CpS) codling moth larvae to determine the possible action of a humoral factor involved in CpGV resistance. Thus, no immune response was observed and no factor in the haemolymph wich induces resistance could be identified. Based on these results it is proposed that virus replication is affected in all cell types, suggesting a virus-cell incompatibility in resistant codling moths. Because no DNA replication could be observed it is proposed that CpGV resistance is caused by an early block of virus replication. The early transcribed gene pe38 encodes for a protein which is putatively responsible for the resistance overcoming capacity of CpGV-I12. Interactions between the protein PE38 and proteins of CpRR1 were investigated using the yeast two-hybrid (Y2H) system. The interactions found are not confirmed by other methods yet. Nevertheless, the Y2H screening revealed two putative genes located on the Z-chromosome and one located on chromosome number 15, which may be involved in resistance to CpGV.