Aplicação de conjugado de microesferas de poliestireno para preparo de RNA no diagnóstico da cinomose canina por RT-qPCR

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Processo FAPESP: 2011/50889-9

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

The diagnosis of canine distemper is usually based on clinical suspicion of the disease. However, due to the different clinical forms of the disease and other disorders common to clinical signs, the laboratory diagnosis is necessary. The RT-PCR followed by NESTED is currently the method used to diagnosis of CDV (Canine Distemper Virus). The Chapter 2 aimed to standardized the technique of One-Step RT-qPCR-using Syber Green I system. Three commercial kits (Sigma®, Promega® and Qiagen®) were tested and compared. Analytical sensitivity of two detection systems (System A and System B) was determined using a standard curve. The three commercial kits tested detected the virus in 100% of samples from symptomatic dogs and the kit of Qiagen® showed better results. The System A detected approximately 10 RNA copies/μL and System B detected approximately 100 RNA copies/ μL in RT-qPCR and 10 RNA copies/ μL when followed by NESTED-qPCR. In Chapter 3 three immunoconjugates were developed with polystyrene microspheres (PM) using polyclonal hyperimmune anti-CDV antibody (IgY, IgG and protein A+IgG) to prepare RNA to canine distemper molecular diagnosis and comparison with the conventional method of RNA extraction by commercial kit. Conjugates were standardized and the analytical sensitivity was determined by standard curve. The diagnostic sensitivity was determined using IgY-conjugated, PM without conjugated antibodies and urine adsorption directly qPCR in tubes

Devido às diversas formas de apresentação clínica e aos sinais clínicos comuns com outras afecções, o diagnóstico laboratorial do CDV (Canine distemper virus) se torna necessário. A RT-PCR seguida da NESTED com amostras de urina é atualmente a técnica mais recomendada para o diagnóstico do CDV. No Capítulo 2, foi desenvolvida a técnica de One-Step-RT-qPCR utilizando o sistema de detecção Syber Green I. Foram testados e comparados três kits comerciais (Sigma®, Promega® e Qiagen®). Foi determinada a sensibilidade analítica de dois sistemas de detecção (Sistema A e Sistema B) utilizando uma curva padrão de RNA sintético. Os três kits comerciais testados detectaram o vírus em 100% das urinas provenientes de animais sintomáticos e o kit da Qiagen® mostrou melhores resultados de reação. O Sistema A detectou aproximadamente 10 cópias de RNA por microlitro e no Sistema B detectou 100 cópias de RNA por microlitro na RT-qPCR e 10 cópias por microlitro quando seguida da NESTED-qPCR. No Capítulo 3 foram desenvolvidos três imunoconjugados de microesferas de poliestireno (MP) utilizando anticorpos policlonais hiperimunes anti-CDV (IgY, IgG e Proteína A+IgG) para o preparo de RNA e aplicação na RT-qPCR. A aplicação dos conjugados foi comparada ao método convencional de extração de RNA por kit comercial. Os conjugados foram padronizados e a sensibilidade analítica foi determinada através de curva padrão de RNA sintético. A sensibilidade diagnóstica foi determinada utilizando-se conjugado com IgY, MP sem anticorpos conjugados e urina adsorvida diretamente nos tubos de qPCR