Enriquecimento ambiental reduz as alterações astrocitárias e a progressão da doença prion em modelo murino: ensaios morfométricos, estereológicos e comportamentais

Já está bem estabelecido que um estilo de vida sedentário é fator de risco para uma série de doenças crônicas, dentre elas a doença de Alzheimer. A neuropatologia da doença de Alzheimer é caracterizada por depósitos amilóides, perda neuronal, gliose reativa e vacuolização da neurópila. A doença príon tem sido amplamente utilizada como modelo experimental para estudar aspectos celulares e moleculares da neurodegeneração crônica em muito semelhante àquela descrita na doença de Alzheimer. O ambiente empobrecido das gaiolas padrão de laboratório tem sido usado para mimetizar um estilo de vida sedentário enquanto que o ambiente enriquecido tem sido empregado para mimetizar um estilo de vida ativo. Para testar a hipótese de que o ambiente enriquecido pode contribuir para desacelerar o curso temporal da neurodegeneração crônica associada à doença príon em modelo murino induzimos a doença príon em vinte camundongos fêmeas da variedade suíça albina que tinham sido alojadas aos seis meses de idade em ambiente enriquecido (EE) ou em ambiente padrão (SE) durante cinco meses. Após esse peródo foram realizadas cirurgias para injeção estereotáxica intracerebral bilateral de homogendao de cérebro de camundongo normal (NBH, n=10) ou de camundongo com sinais clínicos de doença príon terminal (ME7, n=10). Os animais foram devolvidos as suas gaiolas e condições de alojamento originais formando os seguintes grupos experimentais: NBH SE=5, NBH EE=5, ME7 SE=5, ME7 EE=5. Após três semanas foi iniciado teste semanal empregando o burrowing, uma tarefa sensível ao dano hipocampal e 18 semanas após as inoculações realizou-se os testes de memória de reconhecimento de objetos. Encerrados os testes sacrificou-se os animais realizando-se o processamento histológico do tecido nervoso visando a imunomarcação astrocítica das áreas de interesse. A redução progressiva da atividade de burrowing teve início na décima terceira semana pós injeção no grupo ME7 SE e somente na décima quinta semana no grupo ME7 EE. A habilidade de reconhecer o objeto deslocado no teste de memória espacial foi comprometida no grupo ME7 SE, mas se manteve normal nos demais grupos experimentais. O teste de discriminação entre o objeto novo e o familiar não revelou alterações. As análises quantitativas sem viés dos astrócitos imunomarcados para proteína fibrilar ácida (GFAP) foram realizadas no stratum radiatum de CA3 e na camada polimórfica do giro denteado dorsal. As estimativas estereológicas do número total de astrócitos e do volume do corpo celular revelaram que em CA3 somente ocorre hipertrofia dos corpos celulares em animais dos grupos ME7 SE e ME7 EE em relação aos respectivos controles, sendo o volume médio dos corpos celulares do grupo ME7 EE menor que aquele do grupo ME7 SE. Na camada polimórfica houve significativo aumento do número de astrócitos no grupo ME7 SE em relação ao NBH SE e do grupo NBH EE em relação ao NBH SE. O volume do corpo celular também foi significativamente maior nos grupos ME7 em relação aos respectivos controles dos grupos NBH. As análises morfométricas tridimensionais revelaram importante aumento de volume e área de superfície dos segmentos das árvores astrocíticas nos grupos doentes em comparação aos controles. O enriquecimento ambiental reduziu o aumento de volume dos ramos observado no grupo ME7 e aumentou o número de intersecções dos ramos distais no grupo NBH EE em relação ao NBH SE e nos ramos proximais no grupo ME7 EE em relação ao ME7 SE. O emprego da análise de cluster e discriminante permitiu a identificação dos parâmetros morfométricos que mais contribuíram para a distinção entre os grupos. Para testar a hipótese de existirem subfamílias de astrócitos morfologicamente distintos dentro de cada grupo experimental, foi realizada análise de conglomerados que resultou na formação de duas famílias distintas no grupo NBH SE, três famílias nos grupos NBH EE e ME7 EE e quatro famílias no grupo ME7 SE. As bases celulares e moleculares que conduzem a formação de novas famílias de astrócitos e a neuroproteção associada ao ambiente enriquecido que diminui a velocidade de progressão da doença permanecem por serem investigadas.

ABSTRACT: It is well established that a sedentary lifestyle is a risk factor for a number of chronic diseases, including Alzheimer's disease. The neuropathology of Alzheimer's disease is characterized by amyloid deposits, neuronal loss, reactive gliosis, and vacuolization of the neuropil. Prion disease has been widely used as an experimental model for studying cellular and molecular aspects of chronic neurodegeneration much similar to that described in Alzheimer's disease. The impoverished environment of standard laboratory cages have been used to mimic a sedentary life whereas enriched environment has been used to mimic an active lifestyle. To test the hypothesis that an enriched environment can help to slow down the time course of chronic neurodegeneration associated with prion disease we induced prion disease in twenty Swiss albino female mice which had been housed at six months of age in an enriched environment (EE) or in a standard (SE) environment for five months. After this period bilateral stereotactic intracerebral injection of normal (NBH, n = 10) or infected brain homogenate (ME7, n = 10) were done. Infected brain homogenate was obtained from mice with clinical signs of terminal prion disease. The injected animals returned to their cages and housing conditions and grouped as follow: SE = NBH 5, EE = NBH 5, ME7 SE = 5, ME7 EE = 5. After three weeks post-injections the burrowing test was initiated. Burrowing is a sensitive task to hippocampal damage. 18 weeks after inoculation memory tests of object recognition was carried out. After behavioral tests animals were euthanized and their brains were histologically processed targeting astrocytic immunostaining of areas of interest. The progressive reduction of the activity of burrowing began in the thirteenth week after injection in group ME7 SE but only in the fifteenth week in ME7 EE group. The ability to recognize the displaced object in spatial memory test was impaired in ME7 SE group but remained normal in the other experimental groups. The test of discrimination between the new object and the family revealed no abnormalities. Quantitative analysis of GFAP immunostained cells were performed in the dorsal stratum radiatum of CA3 and in the polymorphic layer of the dorsal dentate gyrus. The stereological estimates of the total number of astrocytes and the volume of the cell body revealed that the number of astrocytes did not change but a significant hypertrophy occurs in CA3 cell bodies of ME7 SE and ME7 EE groups as compared to their respective controls. The average volume of the cell bodies of the ME7 EE group was smaller than that of the group ME7 SE. However similar analysis applied to the polymorphic layer revealed a significant increase in the number of astrocytes in the ME7 SE group in relation to NBH SE group and in ME7 EE compared to NBH EE. The volume of the cell body was also significantly higher in ME7 groups compared to their respective control groups. The three-dimensional morphometric analysis revealed significant increase in volume and surface area of the segments of astrocytic trees in diseased groups compared to controls. Environmental enrichment reduced swelling observed in the branches of ME7 group and increased the number of intersections of the distal branches in NBH EE group relative to NBH SE and the proximal branches in the group ME7 EE compared with ME7 SE. The use of cluster analysis and discriminant allowed the identification of morphometric parameters that contributed most to the distinction between the groups. To test the hypothesis that there are subfamilies of morphologically distinct astrocytes within each experimental group, we applied cluster and discriminant analysis to each experimental group and these analysis resulted in the formation of two distinct families in NBH SE group, three families in NBH EE and ME7 EE groups and four families in the ME7 SE group. The molecular and cellular changes, which lead to the formation of new families of astrocytes, and to the neuroprotection associated with an enriched environment slowing down the progression of the prion disease, remain to be investigated.