Ativação espermática e criopreservação do sêmen de macaco-prego (Cebus apella) em diluidores à base de água de coco in natura e TES-TRIS

A espécie Cebus apella (macaco-prego) é amplamente utilizada como modelo experimental na pesquisa biomédica. Entretanto, são escassos os estudos dedicados a avaliar o sêmen desses animais, que é composto por uma fração líquida e uma coagulada de difícil manipulação e alta concentração de espermatozóides imóveis. Portanto, objetivou-se I) avaliar o efeito de duas concentrações de cafeína (6 e 10 mM/mL) diluídas em TES-TRIS e água de coco in natura (ACIN) na ativação de espermatozóides de C. apella e II) testar um protocolo de criopreservação do sêmen comparando dois diluidores (TES-TRIS e ACIN) acrescidos de gema de ovo e glicerol. O sêmen de seis animais mantidos no Centro Nacional de Primatas foi coletado por eletroejaculação, diluído na fração-A de TES-TRIS ou ACIN, e incubado a 35°C até dissolução do coágulo seminal. O tempo de liquefação foi comparado. Posteriormente foi mensurado volume, concentração, morfologia espermática e percentual de espermatozóides vivos. No experimento I as amostras foram diluídas em TES-TRIS ou ACIN acrescidos de 6 e 10 mM de cafeína após o término da motilidade durante a liquefação e mantidas a 35°C. Motilidade e vigor foram avaliados por 5 h. Para o experimento II, após liquefação, o sêmen foi diluído na fração-B (fração-A + gema de ovo e glicerol) dos diluidores, envasado, resfriado a 4°C (2 h), em seguida a -60°C (20 min), antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado a 35°C (5 min). Os resultados foram expressos como média ± EP. O efeito dos diluidores foi comparado pelo teste t Student e ANOVA (p _ 0,05). O coágulo liquefez em 4,5 ± 1,7 e 2,8 ± 1,1 horas (p < 0,05) em TES-TRIS e ACIN respectivamente. O volume médio, concentração, percentual de espermatozóides normais e vivos antes de congelação foi respectivamente 0,6 ± 0,2 mL; 1.806 ± 367 x 106 espermatozóides/mL; 81,3 ± 2, e 40,1 ± 3,3 (TES-TRIS) e 30,9 ± 4 (ACIN). A duração da motilidade em TES-TRIS e ACIN foi, respectivamente, 5 ± 1,4 e 1 ± 0,5 h. A motilidade média nesse período foi 38 ± 10% (TES-TRIS) e 18 ± 9% (ACIN). Foi verificado aumento da motilidade após adição de cafeína apenas nas amostras diluídas em ACIN 6 mM (21 ± 9%) e ACIN 10 mM (22 ± 11) (p > 0,05). O percentual de espermatozóides vivos após descongelação foi 26,2% em TES-TRIS e 13,2% em ACIN (p < 0,05). Para a criopreservação de sêmen de C. apella TES-TRIS é mais indicado e pode, assim como ACIN + cafeína, ser empregado na inseminação artificial com sêmen a fresco diluído.

ABSTRACT: The species Cebus apella (capuchin monkey) is an important experimental model used in biomedical research. However, there are few reports regarding their semen, which is composed by both liquid and coagulated fractions, difficult to handle and containing a high proportion of immobile spermatozoa. Thereafter, the aims of this study were to: I) evaluate the effect of two caffeine concentrations (6 and 10 mM/mL) diluted in TES-TRIS and coconut water solution (CWS) on the activation of C. apella spermatozoa and; II) test and compare two extenders for semen cryopreservation (TES-TRIS and CWS plus egg yolk and glycerol). Semen from six males maintained at the National Primate Center was collected by electroejaculation, diluted in A-fraction of TES-TRIS or CWS, and incubated at 35 °C until coagulum liquefaction. In Experiment I, the samples were diluted in TES-TRIS or CWS plus 6 and 10 mM caffeine after stopped motility during liquefaction and maintained at 35 °C. Motility and vigor were evaluated for 5 h. In Experiment II, after liquefaction, semen was diluted in B-fraction (A-fraction + egg yolk and glycerol) of the extenders, packed, cooled to 4 °C (2 h), then to -60 °C (20 min), before being plunged into liquid nitrogen. Semen was thawed at 35 °C (5 min). The results were expressed as mean ± SEM. The seminal coagulum liquefied in 4.5 ± 1.7 and 2.8 ± 1.1 hours in TES-TRIS and CWS, respectively. Volume, concentration, percentage of normal and live sperm before freezing were, respectively, 0.6 ± 0.2 mL; 1806 ± 367 x 106 spermatozoa/mL; 81.3 ± 2, and 40.1 ± 3.3 (TES-TRIS) and 30.9 ± 4 (CWS). For TES-TRIS and CWS, the duration of sperm motility was 5 ± 1.4 and 1 ± 0.5 hours and mean motility was 38 ± 10% and 18 ± 9%, respectively. Motility increased after caffeine addition only in samples diluted in CWS 6 mM (21 ± 9%) and CWS 10 mM (22 ± 11) (p > 0.05). Post-thaw live sperm percentage was 26.2 in TES-TRIS and 13.2 in CWS (p < 0.05). For cryopreservation of semen from C. apella TES-TRIS was more appropriate than CWS. However, TES-TRIS and CWS + caffeine potentially may be useful in artificial insemination of fresh diluted semen.