Avaliação do efeito protetor da prolactina em linfócitos expostos a ação do metilmercúrio

O mercúrio pode ser encontrado em diversas formas, sendo a orgânica como metilmercúrio (MeHg), considerada a mais tóxica. Facilmente absorvido por via oral, se acumula na cadeia trófica e se amplifica em carnívoros aquáticos, principalmente em peixes, daí o risco maior para as populações que deles se alimentam preferencialmente, como os ribeirinhos Amazônidas. O efeito neurotóxico dessa forma de mercúrio tem sido amplamente demonstrado através de estudos epidemiológicos e experimentais. Alguns desses estudos também mostraram que hormônios e substâncias antioxidantes podem agir protegendo o organismo contra a ação deletéria do mercúrio. A prolactina é um destes hormônios que apresenta ação protetora, mas age também como citocina pró-inflamatória. Desde que o MeHg pode também agir como uma substância imunotóxica, procuramos neste trabalho estudar a ação citoprotetora da PRL em cultivos contínuos de linhagem B95-A de linfócitos de primata afim de avaliar sua fragilidade ao MeHg e sua reatividade a ação da PRL. Com o objetivo de avaliar a integridade funcional dos linfócitos expostos ao MeHg utilizou-se teste de reação colorimétrica para 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio bromide (MTT), o qual detecta atividade metabólica mitocondrial. Para avaliar a resposta imune do linfócito, medidas da concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF α) no sobrenadante do cultivo, foram realizadas por ELISA. É uma citocina pró-inflamatória liberada em resposta a agressão celular de diferentes causas, incluindo estresse oxidativo, um dos efeitos agudos mais evidentes do MeHg, além disso, esta citocina também poder responder a regulação prolactinérgica em linfócitos humanos. Após 18 horas de exposição do cultivo a crescentes concentrações do metal (0,1; 1, 5, 10 e 50 μM) verificou-se significativa diminuição do tipo dose-dependente da viabilidade celular a partir de 1 μM (35%) e progressivamente até 50 μM (80%), quando poucas células íntegras foram encontradas nos cultivos. Um efeito bifásico em forma de “sino” ocorreu na liberação de TNF α, onde concentrações mais baixas de MeHg inibiram (0,1 e 1 μM), a intermediária estimulou (5 μM) e as duas maiores (10 e 50 μM) voltaram a inibir. A prolactina também diminuiu a viabilidade celular, em cerca de 30%, somente na dose mais elevada (10 nM). Por outro lado, na dose de 1 nM a PRL preveniu a diminuição de 40% da viabilidade celular resultante a exposição ao MeHg a 5 μM. Esta dose de 1 nM de PRL foi a única a estimular a liberação de TNF α, mas curiosamente, reverteu a liberação desta citocina quando associada a 5 μM de MeHg, concentração que igualmente estimulou a secreção de TNF α. Os resultados confirmaram a toxidade do MeHg para linfócitos de primatas (linhagem B95-A) e sua reversão por uma possível ação protetora da PRL. Um efeito bifásico na secreção de TNF α resultou da exposição ao MeHg, sugerindo a presença de diferentes mecanismos citotóxicos resultantes a ação mercurial. Por outro lado, a PRL foi pouco efetiva em estimular a secreção daquela citocina, invertendo esta resposta quando associada ao MeHg. No entanto, estes resultados são preliminares e carecem de um estudo mais acurado para sua completa elucidação.

ABSTRACT: Mercury can be found in several forms, as being organic methylmercury (MeHg), considered the most toxic. Readily absorbed orally, accumulates in the food chain and is amplified in aquatic carnivores, especially in fish, hence the greater risk to populations that preferentially feed on them, such as riparian Amazonian populations. The neurotoxic effect of this form of mercury has been widely demonstrated by epidemiological and experimental studies. Some of these studies have also shown that hormones and antioxidants may act by protecting the body against the deleterious effects of mercury. Prolactin is a hormone that has such protective action, but also acts as a proinflammatory cytokine. Since MeHg can also act as an immunotoxic substance, we have studied the cytoprotective action of PRL in continuous cultures of strain B95-A primate lymphocytes in order to assess their vulnerability to MeHg and its responsiveness to the action of PRL. In order to assess the functional integrity of lymphocytes exposed to MeHg we used to test color reaction for 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), which detects activity mitochondrial metabolism. To evaluate the immune response of lymphocytes, measures of tumor necrosis factor alpha (TNF α) concentration in the middle were performed by ELISA. It is a proinflammatory cytokine released in response to cellular injury from different causes, including oxidative stress, one of the most obvious acute effects of MeHg, and this cytokine also be able to answer prolactin regulation in human lymphocytes. After 18 hours of cultivation exposure to increasing concentrations of the metal (0.1, 1, 5, 10 and 50 mM) showed significant decrease in dose-dependent cell viability from 1 mM (35%) and progressively up to 50 mM (80%), when few intact cells were found in the cultivation. A biphasic effect in a "bell" shaped occurred in the release of TNF-α, where lower concentrations of MeHg inhibited (0.1 and 1 mM) stimulated the intermediate (5 mM) and the two largest (10 and 50 mM) returned to inhibit. Prolactin also decreased the cell viability by about 30% only at the highest dose (10 nM).Moreover, at a dose of 1 nM prevented PRL 40% decrease in cell viability due to exposure to 5 mM MeHg. This dose of 1 nM PRL was the only one to stimulate the release of TNF-α, but curiously reversed the release of this cytokine when combined with 5 mM of MeHg, concentrations that also stimulated the secretion of TNF-α. The results confirmed the toxicity of MeHg to lymphocytes of primates (strain B95-A) and its reversion by possible protective action of PRL. A biphasic effect on the secretion of TNF α resulted from MeHg exposure, suggesting the presence of different mechanisms of cytotoxic action resulting from mercury. Moreover, PRL was less effective in stimulating the secretion of that cytokine, reversing this response when the associated with MeHg. However, these results are preliminary and require a more accurater study for their complete elucidation.