Caracterização genética parcial e completa da nucleoproteína de hantavírus na Amazônia brasileira

A Síndrome Pulmonar por Hantavírus (SPH) vem sendo diagnosticada na Amazônia brasileira desde 1995. Até dezembro de 2010 já foram diagnosticados 289 casos na Amazônia brasileira, registrados nos estados do Mato Grosso, Pará, Maranhão, Amazonas e Rondônia. O objetivo geral do presente estudo foi caracterizar geneticamente cepas de hantavirus circulantes nesses estados. Foram utilizadas amostras de vísceras de roedores silvestres positivos para anticorpos IgG contra hantavírus, capturados em estudos ecoepidemiológicos, realizados nos municípios de Itacoatiara/AM, Alto Paraíso/RO e Campo Novo do Parecis/MT, e soro/sangue de casos humanos de SPH provenientes dos municípios da área de influência da BR-163, nos estados do Pará e Mato Grosso, Tomé-Açu/PA, Tangará da Serra/MT, além de pool de vísceras de um óbito procedente de Anajatuba/MA. As amostras foram submetidas à extração de RNA viral, seguida das reações de RT-Hemi-Nested-PCR para amostras de roedores, RT-Nested-PCR para amostras de humanos e sequenciamento nucleotídico, utilizando o método de Sanger e o pirossequenciamento, sendo, posteriormente, verificados quanto a aspectos como, identidade (BLAST search), similaridade (SimPlot) e homologia nucleotídica e aminoacídica com outros hantavírus (Clustal W). Foram obtidas as sequências parciais dos hantavírus em cinco roedores da espécie Oligoryzomys microtis (n=2 de Itacoatiara/AM; n=3 de Alto Paraíso/RO) e em oito amostras de humanos (n=1 de Tomé-Açu/PA; n=1 de Altamira/Cachoeira da Serra; n=1 de Novo Progresso/PA; n=1 de Guarantã do Norte/MT; n=1 de Anajatuba/MA e n=3 de Altamira/Castelo dos Sonhos). Com a utilização da estratégia do pirossequenciamento foram obtidas as sequências completas do gene N, S-RNA dos hantavírus em três roedores (n=2 de Alto Paraíso/RO e n=1 de Campo Novo do Parecis/MT) e dois casos humanos (n=1 de Tangará da Serra/MT e n=1 de Novo Progresso/PA). As análises das sequências completas demonstraram a presença de ORFs para uma possível proteína NSs, já descrita para outros hantavírus. As análises filogenéticas entre as sequências obtidas neste estudo e de outros hantavírus disponíveis no GenBank sugerem que, o vírus Castelo dos Sonhos é o responsável pelos casos de SPH em municípios da área de influência da BR-163, obtendo-se, pela primeira vez, a sequência completa desse vírus em roedor Oligoryzomys utiaritensis, capturado no Mato Grosso; confirmou-se a circulação contínua do vírus Laguna Negra-like, associado aos casos de SPH no estado do Mato Grosso; o vírus Mamoré-like foi detectado pela primeira vez em roedores O.microtis, nos estado do Amazonas e Rondônia, porém não associado a casos humanos; o vírus Anajatuba foi o responsável por um caso de óbito proveniente do Maranhão. Esse trabalho servirá como suporte para estudos moleculares e epidemiológicos futuros, pois, fornece dados inéditos acerca da transmissão das hantaviroses na Amazônia brasileira.

ABSTRACT: The Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) has been diagnosed in the Brazilian Amazon since 1995. Until december 2010 have been diagnosed 289 cases in the Brazilian Amazon, registered in the states of Mato Grosso, Pará, Maranhão, Amazonas and Rondônia. The overall objective of this study was to characterize genetically hantavirus strains circulating in these states. Samples of viscera from wild rodents positive for IgG antibodies against hantavirus caught in ecoepidemiológicos studies, conducted in the municipalities of Itacoatiara/AM, Alto Paraíso/RO and Campo Novo do Parecis/MT, and serum/blood of human cases of HPS from the municipalities in the area of influence of BR-163 in the states of Pará and Mato Grosso, Tomé-Açu/PA, Tangará da Serra/MT, and viscera of a pool of death coming from Anajatuba/MA. The samples were extracted viral RNA, followed by the reactions of RT-Hemi-Nested-PCR for samples from rodents, RT-Nested-PCR for human samples and nucleotide sequencing using the Sanger method and pyrosequencing, and later, scanned for matters such as identity (BLAST search), similarity (Simplot) and nucleotide and aminoacidic homology with other hantaviruses (Clustal W). We obtained partial sequences of hantavirus in five species of rodents Oligoryzomys microtis (n=2 from Itacoatiara/AM; n=3 from Alto Paraíso/RO) and in eight samples from humans (n=1 from Tomé-Açu/PA; n=1 from Altamira/Cachoeira da Serra; n=1 from Novo Progresso/PA; n=1 from Guarantã do Norte/MT; n=1 de Anajatuba/MA and n=3 de Altamira/Castelo dos Sonhos). Using the strategy of pyrosequencing were obtained complete sequences of the gene N, S-RNA of three hantavirus in rodents (n=2 from Alto Paraíso/RO and n=1 from Campo Novo do Parecis/MT) and two human cases (n=1 from Tangará da Serra/MT and n=1 from Novo Progresso/PA). Analysis of complete sequences showed the presence of ORFs for possible NSs protein, as described for other hantaviruses. Phylogenetic analysis of the sequences obtained in this study and other hantaviruses available in GenBank suggests that the virus Castelo dos Sonhos is responsible for cases of HPS in municipalities in the area of influence of BR-163, obtaining for the first time, the complete sequence of this virus in rodent Oligoryzomys utiaritensis, coming from Mato Grosso; confirmed the continued circulation of Laguna Negra-like virus associated with HPS cases in the state of Mato Grosso; the Rio Mamoré-like virus was first time detected in O.microtis rodents, the state of Amazonas and Rondônia, but not associated with human cases; the virus Anajatuba was responsible for a case of death from Maranhão. This work will serve as support for future epidemiological and molecular studies, therefore, provides new data about the spread of hantaviruses in the Brazilian Amazon.