Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in calf fecal samples by direct immunofluorescence assay

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Processo FAPESP: 08/57380-1

O objetivo deste estudo foi produzir um conjugado contendo anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium parvum e padronizar a Reação de Imunofluorescência Direta (RID), para detecção de oocistos de C. parvum em amostras fecais de bezerros. Para produção de anticorpos policlonais anti-C. parvum, dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com uma solução purificada de oocistos de C. parvum e adjuvante de Freund. A purificação da fração de imunoglobulina G (IgG) foi realizada por meio de precipitação em sulfato de amônio e cromatografia em coluna de DEAE celulose. A titulação dos anticorpos policlonais anti-C. parvum foi determinada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). A fração IgG de coelho anti-C. parvum foi conjugada com isotiocianato de fluoresceína, e a padronização da RID foi feita utilizando-se várias diluições do conjugado, em lâminas positivas para C. parvum. Foi pesquisada também a presença de reatividade cruzada do conjugado anti-C. parvum com C. serpentis, C. andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.. A produção do conjugado anti-C. parvum foi bem sucedida, sendo possível a padronização da RID para detecção de oocistos em fezes. Foi também observada reatividade cruzada dos anticorpos policlonais anti-C. parvum, com C. andersoni e C. serpentis.

The aim of this study was to produce a conjugate containing anti-Cryptosporidium parvum polyclonal antibodies and standardize a Direct Immunofluorescence Assay (DIF) for detecting C. parvum oocysts in fecal samples from calves. In order to obtain anti-C. parvum polyclonal antibodies, two New Zealand rabbits were immunized with a purified solution of C. parvum oocysts and Freund's adjuvant. Purification of the immunoglobulin G (IgG) fraction was performed by means of precipitation in ammonium sulfate and chromatography using a DEAE-cellulose column. The anti-C. parvum polyclonal antibody titer was determined by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The rabbit anti-C. parvum IgG fraction was conjugated with fluorescein isothiocyanate and standardization of the DIF was performed using various dilutions of conjugate on slides positive for C. parvum oocysts. The cross-reactivity of the anti-C. parvum conjugate was tested using oocysts of Cryptosporidium serpentis, Cryptosporidium andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp., and Candida sp. An anti-C. parvum conjugate was successfully produced, thus allowing standardization of DIF for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples. Cross-reactivity of anti-C. parvum polyclonal antibodies with C. andersoni and C. serpentis was also observed.