Influência das condições de cultivo na produção de antígenos recombinantes de Leishmania i. chagasi utilizando Escherichia coli M15 cultivada em incubador rotativo e biorreator

Escherichia coli has been one of the most widely used hosts in recombinant protein production, in both laboratory and industrial scale since the advent of recombinant DNA technology. Despite the substantial progress of studies on the molecular biology and immunology of infections, there is currently no medication-based prophylaxis capable of preventing leishmaniasis. As such, there is a great need to identify specific antigens for the development of vaccines and diagnostic kits against visceral leishmaniasis. Thus, the primary goal of the present study is to assess the influence of cultivation conditions on the production of Leishmania chagasi antigens, carried out in a rotating incubator and bioreactor. To that end, several assays were conducted to evaluate the kinetic behavior of antigens (648, 503) of Leishmania. i. chagasi in two different compositions of media (2xTY, TB), with and without an inducer. In order to improve expression, assays were performed in a benchtop bioreactor using the best conditions obtained in a rotating incubator, in addition to assessing the influence of stirring speed. Results show that high complexity of the cultivation medium favored kinetic growth of clones (648, 503). However, in assays submitted to induction by IPTG, this elevated complexity did not promote the expression of recombinant proteins. Expression of antigens 648 and 503 exhibited behavior associated with growth and, in terms of location, proteins 648 and 503 are intracellularly stored. Lactose may be the most adequate inducer in protein expression, when considering factors, cost, toxicity and stability. Elevated stirring may increase cell growth in clone 53, although it may not result in high concentrations for the protein of interest. On the other hand, positive results were obtained for all recombinant clones (648, 503) tested, confirmed by the electrophoretic profile

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A Escherichia coli é um dos hospedeiros mais utilizados para produção de proteínas recombinantes tanto em escala de laboratório como em escala industrial desde o advento da tecnologia do DNA recombinante. Apesar do avanço expressivo dos estudos da biologia molecular e da imunologia das infecções, não existe, atualmente, nenhuma droga profilática capaz de prevenir o calazar. Desta forma, existe uma grande necessidade de identificação de antígenos específicos para o desenvolvimento de vacinas e kits para diagnósticos contra a Leishmaniose visceral. Com base no exposto, o presente trabalho tem como foco principal avaliar a influência das condições de cultivo na produção dos antígenos de Leishmania i. chagasi em cultivos realizados em incubador rotativo e biorreator. Para atingir o objetivo proposto, vários ensaios foram realizados a fim de se avaliar o comportamento cinético dos clones (648, 503) de Leishmania i. chagasi em duas diferentes composições de meio (2xTY, TB), com e sem adição de indutor em incubador rotativo. Para melhorar a expressão, ensaios foram conduzidos em biorreator de bancada com as melhores condições obtidas em incubador rotativo, além da avaliação da influência da velocidade de agitação. Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que a elevada complexidade do meio de cultivo favoreceu a cinética de crescimento dos clones (648, 503), no entanto, ao se tratar dos ensaios submetidos ao procedimento de indução por IPTG, a elevada complexidade do meio de cultivo não favoreceu a expressão das proteínas recombinantes. Pode-se observar que a expressão dos antígenos 648 e 503 apresentam um comportamento associado ao crescimento e que em termos de localização, as proteínas 648 e 503, são armazenadas intracelularmente. A lactose pode ser o indutor mais adequado na expressão das proteínas tendo em vista os fatores, custo, toxicidade e estabilidade. A elevada agitação pode aumentar o crescimento celular do clone 503, entretanto, pode não acarretar em altas concentrações da proteína de interesse. Por outro lado, foram obtidos resultados positivos para todos os clones recombinantes (648, 503) testados, confirmada através do perfil eletroforético