Análise metagenômica da microbiota de ambientes aquáticos do estado do Rio Grande do Norte - Brasil

The screening for genes in metagenomic libraries from soil creates opportunities to explore the enormous genetic and metabolic diversity of microorganisms. Rivers are ecosystems with high biological diversity, but few were examined using the metagenomic approach. With this objective, a metagenomic library was constructed from DNA soil samples collected at three different points along the Jundiaí-river (Rio Grande do Norte-Brazil). The points sampled are from open area, rough terrain and with the direct incidence of sunlight. This library was analyzed functionally and based in sequence. For functional analysis Luria-Bertani solid medium (LB) with NaCl concentration varied from 0.17M to 0.85M was used for functional analysis. Positives clones resistant to hypersaline medium were obtained. The recombinant DNAs were extracted and transformed into Escherichia coli strain DH10B and survival curves were obtained for quantification of abiotic stress resistance. The sequences of clones were obtained and submitted to the BLASTX tool. Some clones were found to hypothetical proteins of microorganisms from both Archaea and Bacteria division. One of the clones showed a complete ORF with high similarity to glucose-6-phosphate isomerase which participates in the synthesis of glycerol pathway and serves as a compatible solute to balance the osmotic pressure inside and outside of cells. Subsequently, in order to identify genes encoding osmolytes or enzymes related halotolerance, environmental DNA samples from the river soil, from the water column of the estuary and ocean were collected and pyrosequenced. Sequences of osmolytes and enzymes of different microorganisms were obtained from the UniProt and used as RefSeqs for homology identification (TBLASTN) in metagenomic databases. The sequences were submitted to HMMER for the functional domains identification. Some enzymes were identified: alpha-trehalose-phosphate synthase, L-ectoina synthase (EctC), transaminase L-2 ,4-diaminobutyric acid (EctB), L-2 ,4-diaminobutyric acetyltransferase (EctA), L-threonine 3 dehydrogenase (sorbitol pathway), glycerol-3-phosphate dehydrogenase, inositol 3-phosphate dehydrogenase, chaperones, L-proline, glycine betaine binding ABC transporter, myo-inositol-1-phosphate synthase protein of proline simportadora / PutP sodium-and trehalose-6-phosphate phosphatase These proteins are commonly related to saline environments, however the identification of them in river environment is justified by the high salt concentration in the soil during prolonged dry seasons this river. Regarding the richness of the microbiota the river substrate has an abundance of halobacteria similar to the sea and more than the estuary. These data confirm the existence of a specialized response against salt stress by microorganisms in the environment of the Jundiaí river

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A busca por genes baseada na construção e análise de bibliotecas metagenômicas a partir de solo gera oportunidades para explorar uma enorme diversidade genética e metabólica de microrganismos. Os rios são ecossistemas com alta diversidade biológica, mas ainda pouco explorados por meio de metagenômica. Com o objetivo de explorar a diversidade microbiana, uma biblioteca metagenômica foi construída a partir de DNA extraído de substrato de rio em três pontos ao longo do rio Jundiaí (Rio Grande do Norte-Brasil). Os pontos de amostragem são derivados de área aberta, terreno acidentado e com a incidência direta da luz solar. Esta biblioteca foi analisada funcionalmente e também com base em sequências. Para a análise funcional foi utilizado meio de cultura sólido LB com concentração de NaCl variando de 0,17M a 0,85M. Foram obtidos 15 clones positivos com características halotolerantes. Os DNAs recombinantes foram extraídos e retransformados em cepa de Escherichia coli DH10B e curvas de sobrevivência foram obtidas para confirmação e quantificação da resistência ao estresse abiótico. As sequências dos clones foram obtidas e submetidas a ferramenta BLASTX e assim foi comprovado que alguns clones codificavam proteínas hipotéticas. Um dos clones apresentou uma ORF completa com elevada similaridade de glucose-6-fosfato-isomerase que participa na síntese do precursor de glicerol, sendo um soluto compatível para equilibrar a pressão osmótica no interior e no exterior das células. Posteriormente, para identificação de genes que codificam osmólitos relacionados com halotolerância e identificação da diversidade microbiológica, amostras de DNA ambiental do substrato do rio e da coluna d´água do estuário e oceano foram coletadas e pirosequenciadas. As sequências de osmólitos de diferentes microrganismos foram obtidas a partir do UniProt e utilizadas como RefSeqs para a identificação por homologia (TBLASTN) nos bancos de dados metagenômicos. As sequências identificadas nos bancos de dados ambientais foram submetidas ao programa HMMER com o fim de identificar domínios funcionais. Foram identificadas as enzimas: alfa-trealose-fosfato sintase, L-ectoina sintase (ectC), transaminase do ácido L-2,4-diaminobutírico (EctB), ácido L-2 ,4-diaminobutírico acetiltransferase (EctA), L-treonina 3-desidrogenase (via de síntese do sorbitol), Glicerol-3-fosfato desidrogenase, inositol-3-fosfato desidrogenase, chaperonas, L-prolina glicina betaína ligação transportador ABC, mio-inositol-1-fosfato sintase, a proteína simportadora de prolina/sódio -PutP e trealose-6-fosfato fosfatase. Estas são enzimas que participam da síntese de osmólitos comumente relacionados a ambientes salinos, no entanto a identificação desses solutos em ambiente de rio é justificada pela elevada concentração salina no solo durante prolongadas estações de seca neste rio. Quanto à riqueza da microbiota foi identificado que o substrato do rio possui uma abundância de halobactérias semelhante a do mar e superior a do estuário. Esses dados confirmam a existência de uma resposta especializada contra o estresse salino por microrganismos no ambiente do rio Jundiaí