Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais humanas jovens e senescentes

Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study, for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence. Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with the GeneChip ® 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically significant differences in expression to p-value Bonferroni correction ˂.01. Only signals with fold change ˃ 3.0 were included in the list of differentially expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape 2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The comparison between senescent and young at each group of MSC has shown that there is a difference in the expression parttern, being higher in the senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are senescent. New networks were identified for genes related to the response of two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1, xvi EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data suggests that the population of MSC/inv has different constitutional characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo assays

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) são muito úteis na terapia celular. O longo período de cultivo pode resultar em senescência replicativa ou estar relacionado com o aparecimento de alterações cromossômicas responsáveis pela aquisição de um caráter tumorigênico in vitro . Neste estudo, foi comparado o transcriptoma de CTMH jovens e senescentes obtidas de diferentes doadores. Além disso, pela primeira vez, o perfil de expressão de CTMH com uma inversão cromossômica paracêntrica (CTMH/inv) foi comparado ao de CTMH que possuem cariótipo normal (CTMH/n) em passagens jovens e senescentes de cultivo in vitro . As CTMH utilizadas neste estudo foram isoladas da veia do cordão umbilical de três dadores, dois CTMH/n e de um CTMH/inv. Após a criopreservação, elas foram expandidas in vitro até alcançarem a senescência. O RNA total foi extraído utilizando o RNeasy mini kit (Qiagen), marcado, purificado e fragmentado com o ® 3 GeneChip IVT expresso Kit (Affymetrix, Inc.). Subsequentemente, o RNA fragmentado foi hibridado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Inc.). A análise estatística da expressão diferencial foi realizada usando o Partek Suite Software Genomic, versão 6.4 (Partek, Inc.). Foram consideradas estatisticamente significativas as diferenças na expressão com valor de P ˂0.01 corrigido com Bonferroni. Apenas os sinais com fold change ˃3.0 foram incluídos na lista de diferencialmente expressos. Diferenças na expressão gênica observadas no estudo dos microarranjos foram confirmadas por resultados de RT-PCR em tempo real. Para a interpretação biológica dos dados foram utilizados: IPA (Ingenuity Systems) para análise de enriquecimento de funções; STRING 9,0 para a construção de redes de interações; Cytoscape 2,8 para a visualização das redes e análises de gargalos com o auxílio do software GraphPad Prism 5.0. O pluggin BiNGO do Cytoscape foi utilizado para avaliar a representação de categorias funcionais no Gene Ontology nas redes biológicas. A comparação entre senescentes e jovens em cada grupo de CTMH mostrou que há uma diferença no perfil de expressão, sendo maior nas senescentes do grupo CTMH/inv. Os resultados também mostraram que há diferença nos perfis de expressão entre as CTMH/inv e CTMH/n, sendo maior a diferença quando as células estão senescentes. Novas xiv redes foram identificadas para genes relacionados com a resposta ao longo do tempo de cultivo nos dois grupos de CTMH. Foram identificados genes que podem coordenar funções importantes mais enriquecidas nas redes, como por exemplo, CXCL12, SFRP1, EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. A interpretação biológica destes dados sugere que a população de células CTMH/inv tem diferentes características constitucionais, relacionadas com o seu potencial de proliferação, diferenciação e resposta a estímulos, responsáveis por um processo de senescência replicativa em CTMH/inv distinto das CTMH/n. Os genes identificados neste estudo são candidatos a marcadores da senescência celular em CTMH, mas a sua relevância funcional neste processo deve ser testada em experiências adicionais in vitro e/ou in vivo