Développement de nouvelles formulations d’antifongiques et évaluation de l’activité sur Candida spp. et Aspergillus spp.

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse de doctorat avaient pour but de mettre au point des nouvelles formulations d’antifongiques sous forme de nanoparticules polymériques (NP) en vue d’améliorer l’efficacité et la spécificité des traitements antifongiques sur des souches sensibles ou résistantes de Candida spp, d’Aspergillus spp et des souches de Candida albicans formant du biofilm. Dans la première partie de ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un polymère à base de polyester-co-polyéther branché avec du poly(éthylène glycol) (PEG-g-PLA). En plus d’être original et innovant, ce co-polymère a l’avantage d’être non-toxique et de posséder des caractéristiques de libération prolongée. Trois antifongiques couramment utilisés en clinique et présentant une biodisponibilité non optimale ont été choisis, soient deux azolés, le voriconazole (VRZ) et l’itraconazole (ITZ) et un polyène, l’amphotéricine B (AMB). Ces principes actifs (PA), en plus des problèmes d’administration, présentent aussi d’importants problèmes de toxicité. Des NP polymériques encapsulant ces PA ont été préparées par une technique d’émulsion huile-dans-l’eau (H/E) suivie d’évaporation de solvant. Une fois fabriquées, les NP ont été caractérisées et des particules de d’environ 200 nm de diamètre ont été obtenues. Les NP ont été conçues pour avoir une structure coeur/couronne avec un coeur constitué de polymère hydrophobe (PLA) et une couronne hydrophile de PEG. Une faible efficacité de chargement (1,3% m/m) a été obtenue pour la formulation VRZ encapsulé dans des NP (NP/VRZ). Toutefois, la formulation AMB encapsulée dans des NP (NP/AMB) a montré des taux de chargement satisfaisants (25,3% m/m). En effet, le caractère hydrophobe du PLA a assuré une bonne affinité avec les PA hydrophobes, particulièrement l’AMB qui est le plus hydrophobe des agents sélectionnés. Les études de libération contrôlée ont montré un relargage des PA sur plusieurs jours. La formulation NP/AMB a été testée sur un impacteur en cascade, un modèle in vitro de poumon et a permis de démontrer le potentiel de cette formulation à être administrée efficacement par voie pulmonaire. En effet, les résultats sur l’impacteur en cascade ont montré que la majorité de la formulation s’est retrouvée à l’étage de collecte correspondant au niveau bronchique, endroit où se situent majoritairement les infections fongiques pulmonaires. Dans la deuxième partie de ces travaux, nous avons testé les nouvelles formulations d’antifongiques sur des souches planctoniques de Candida spp., d’Aspergillus spp. et des souches de Candida albicans formant du biofilm selon les procédures standardisées du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Les souches choisies ont démontré des résistances aux azolés et aux polyènes. Les études d’efficacité in vitro ont permis de prouver hors de tout doute que les nouvelles formulations offrent une efficacité nettement améliorée comparée à l’agent antifongique libre. Pour mettre en lumière si l’amélioration de l’efficacité antifongique était due à une internalisation des NP, nous avons évalué le comportement des NP avec les cellules de champignons. Nous avons procédé à des études qualitatives de microscopie de fluorescence sur des NP marquées avec de la rhodamine (Rh). Tel qu’attendu, les NP ont montré une localisation intracellulaire. Pour exclure la possibilité d’une simple adhésion des NP à la surface des levures, nous avons aussi confirmé leur internalisation en microscopie confocale de fluorescence. Il est important de noter que peu d’études à ce jour ont mis l’accent sur l’élaboration de nouvelles formulations d’antifongiques à base de polymères non toxiques destinées aux traitements des mycoses, donnant ainsi une grande valeur et originalité aux travaux effectués dans cette thèse. Les résultats probants obtenus ouvrent la voie vers une nouvelle approche pour contourner les problèmes de résistances fongiques, un problème de plus en plus important dans le domaine de l’infectiologie.

The work done presented in this thesis was aimed to develop new formulations of antifungal drugs in order to improve the effectiveness and specificity of treatments. The formulations of polymeric NP encapsulated antifungals were tested on sensitive or resistant strains of Candida spp, Aspergillus spp and strains of Candida albicans that are able to develop biofilm structure. The first part of this work focussed on the synthesis and characterizations of a polyester-co-polyether polymer grafted with poly(ethylene glycol) (PEG-g-PLA). Besides being original and innovative, polymeric nanoparticles composed of PEG-g-PLA co-polymers have been used as drug delivery devices due to their biodegradable and biocompatible nature and controllable release characteristics. Three antifungal drugs (voriconazole, itraconazole and amphotericin B) commonly administered have been selected due to physicochemical properties and pharmacokinetics problems. In fact, these drugs are known to have significant delivery and toxicity issues. Polymeric nanoparticles were prepared by a high pressure homogenization oil-in-water emulsion method. Nanoparticles were designed in order to have an hydrophobic core (PLA) and a hydrophilic corona (PEG). Antifungal drugs were successfully incorporated into nanoparticles with appropiate mean diameters (~ 200 nm). Drug loading efficiency for VRZ was the lowest with 1,3% w/w of loading. A fraction of the VRZ was lost during the manufacturing process because of its solubility in water. However, AMB encapsulated in NP showed better loading efficiency (25,3% w/w). Indeed, the hydrophobic nature of PLA ensured a good affinity with the hydrophobic drugs, particularly for AMB who is the most hydrophobic of the selected drugs. Drug release study from new formulations showed a burst effet during 24 h followed by a prolonged release over several days. Furthermore, new formulation of AMB was tested on a cascade impactor, an in vitro lung model and successfully demonstrated the potential of this formulation to be administered effectively by the pulmonary route. Indeed, the results obtained showed that the majority of the formulation was found on the collection stage corresponding to the bronchial region, where is located predominantly pulmonary fungal infections. The second part of the thesis was aimed at testing the new formulations on planktonic strains of Candida spp and Aspergillus spp. and biofilm structure of Candida albicans according to NCCLS standardized procedures. The selected strains have demonstrated resistance to azoles and polyenes. Studies in vitro have proven that the new formulations offer significantly improved effictiveness compared to free antifungal agent. To evaluate if improved antifungal effectiveness was due to internalization of NP, we evaluated the behavior of NP with fungal cells. We conducted qualitative studies in fluorescence microscopy on NP labeled with rhodamine. As expected, the NP showed intracellular localization. To exclude the possibility of NP absorption on the surface of yeast cells, we also confirmed internalization by confocal fluorescence microscopy. Noteworthy, only a few studies have focused on the development of new formulations of antifungal drug, giving great value and originality of this work. Encouraging results pave the way to a new approach to overcome fungal resistance issues, a problem more acute in the field of fungal diseases.