Implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse du chloroplaste en association avec la protéine SIG6

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6.

The autotrophic lifestyle of plants relies entirely on the integrity of chloroplasts and particularly on their biogenesis. Chloroplast gene transcription, performed by a Plastid-Encoded Polymerase (PEP) and two Nuclear-Encoded Polymerases (NEPs), is one of the key steps during the development of photosynthetic chloroplast. There are 3 classes of genes, one transcribed by PEP alone (class I), one by both PEP and NEPs (class II), and the third by NEPs alone (class III). To carry out transcription, PEP associates with plastid sigma factors including the general sigma factor SIG6. sig6 mutants have a pale cotyledon phenotype, a severe decrease in class I gene transcription and a reduction in the level of class I proteins. In our laboratory, we study the role of the two plastid WIHRLY proteins (WHY1 and WHY3) in maintaining plastid genome stability. However, little is known about any role these proteins may play in transcription or chloroplast biogenesis. It seems likely they are involved in plastid gene transcription since they are found in the Plastid Transcriptionally Active Chromosome (PTAC). Moreover, they have been implicated in chloroplast biogenesis in maize. In this study, we verified the implication of these proteins in plastid biogenesis using a genetic approach in which we crossed a sig6 mutant with a why1why3 mutant. We isolated sig6why1 and sig6why3 double mutants and a sig6why1why3 triple mutant. Using a phenotypic characterisation and quantification of some plastid proteins, we show that loss of one of the two Why genes complements the sig6 pale cotyledon phenotype and allows a more normal pattern of expression of plastid proteins that are under-expressed in the sig6 mutant. However, we also show that loss of the two Why genes does not alleviate the sig6 phenotype. Moreover, the triple mutant shows a second pale phenotype on true leaves, and the plastid protein expression pattern is abnormal compared to either sig6 or wild type plants. Those results cannot be explained by the role of WHIRLY proteins in plastid genome stability since the triple mutant shows fewer plastid genome rearrangements than the why1why3 mutant. Finally, we show that inhibition of the PEP polymerase using rifampicin elicits the same complementation of the sig6 phenotype as the loss of one of the two WHIRLY. Together, these results show the implication of WHIRLY proteins in plastid biogenesis in association with SIG6. We propose a model in which WHIRLY act as activators of PEP activity, particularly during the chloroplast biogenesis. Therefore, the absence of one of the WHIRLY would cause a weak inhibition of PEP, facilitating the set-up of a rescue mechanism by NEPs and, consequently, allowing the complementation of plastid biogenesis in the sig6 mutant. However, the absence of the two WHIRLY proteins would cause a strong inhibition of PEP, and the inability of the rescue mechanism by NEPs to compensate for this strong inhibition, resulting in a more severe phenotype in the sig6 mutant.