Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

Hematopoietic stem cells (HSC) are rare, but essential to sustain the constant production of all mature blood cells, a constantly renewing tissue. They are defined by two main characteristics; namely self-renewal (SR), or the capacity to preserve cell identity following division, and multipotency, the differentiation potential that allows them to generate all hematopoietic lineages. Given their attributes, HSC are used for cellular therapy in the transplantation field. A hierarchy in tissue organisation is also preserved in leukemia, or blood cancer, a heterogeneous tumor mass that is sustained by a subset of cells with unlimited SR potential, the leukemia stem cells (LSC). Studies presented in this manuscript aim to explore the molecular basis underlying SR, which are still poorly defined. Certain members of the HOX family of homeodomain transcription factors are involved in the regulation of normal hematopoiesis, and their deregulation can contribute to leukemia development. In particular, Hoxb4 overexpression in HSC influences cells fate, favouring SR divisions and their subsequent expansion in culture and in vivo. In general, HSC exhaust rapidly when maintained ex vivo, outside of their niche. Several factors interact with HOX and modulate their binding to DNA, including members of the TALE (Three Amino acid Loop Extension) protein family, such as MEIS1 and PBX1. Using a strategy of combined overexpression of Hoxb4 and an anti-sense to Pbx1in HSC, generating Hoxb4hiPbx1lo cells, it is possible to further impact on their SR potential and expansion in vitro. These Hoxb4hiPbx1lo cells remain functionally intact despite extreme modulation of their cell fate in culture. Levels of expression of nuclear factors, alone or in combination, can thus impact significantly on HSC fate. In order to identify other nuclear factors potentially involved in the process of HSC self-renewal, a strategy enabling simultaneous assessment several gene candidates was elaborated. To this end, progress made in terms of HSC purification and their culture in micro-wells facilitated the setup of an RNAi (RNA interference) screen, measuring the functional impact of lowering gene candidate transcript levels on HSC activity. Gene candidates selected for this study belong to the greater group of chromatin modifiers, more specifically the family of histone demethylases (HDM) containing a Jumonji catalytic domain. This choice stems from the regulatory function of several members of histone methyl-transferase complexes on HSC self-renewal, including the histone methyl-transferase MLL (Mixed Lineage Leukemia). This strategy was also used in the laboratory to study the role of asymmetry factors on HSC fate, in a collaborative study. These studies enabled identification of both positive and negative regulators of HSC activity. Among these, reduced expression of the gene coding for JARID1B, a histone 3 lysine 4 (H3K4) HDM, increased HSC activity was associated with Hox genes activation. In conclusion, several nuclear determinants, including transcription factors and chromatin modifiers, can influence HSC fate. Underlying mechanisms and identification of additional modulators of SR remain areas to explore, which could eventually contribute to HSC expansion strategies ex vivo, and identification of therapeutic targets against LSC. Keywords: hematopoietic stem cells, Hoxb4, Pbx1, self-renewal, histone demethylases, RNAi