Étude de la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus dans la noirceur

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote.

The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.