Desenvolvimento de Anticorpos Plásticos para um Biomarcador do Cancro

O trabalho descrito compreende o desenvolvimento de um anticorpo plástico (MIP, do inglês Molecularly Imprinted Polymer) para o antigénio carcinoembrionário (CEA, do inglês Carcinoembriogenic Antigen) e a sua aplicação na construção de dispositivos portáteis, de tamanho reduzido e de baixo custo, tendo em vista a monitorização deste biomarcador do cancro do colo-retal em contexto Point-of-Care (POC). O anticorpo plástico foi obtido por tecnologia de impressão molecular orientada, baseada em eletropolimerização sobre uma superfície condutora de vidro recoberto por FTO. De uma forma geral, o processo foi iniciado pela electropolimerização de anilina sobre o vidro, seguindo-se a ligação por adsorção do biomarcador (CEA) ao filme de polianilina, com ou sem monómeros carregados positivamente (Cloreto de vinilbenziltrimetilamónio, VB). A última fase consistiu na electropolimerização de o-fenilenodiamina (oPD) sobre a superfície, seguindo-se a remoção da proteína por clivagem de ligações peptídicas, com o auxílio de tripsina. A eficiência da impressão do biomarcador CEA no material polimérico foi controlada pela preparação de um material análogo, NIP (do inglês, Non-Imprinted Polymer), no qual nem a proteína nem o monómero VB estavam presentes. Os materiais obtidos foram caracterizados quimicamente por técnicas de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR, do inglês, Fourier Transform Infrared Spectroscopy) e microscopia confocal de Raman. Os materiais sensores preparados foram entretanto incluídos em membranas poliméricas de Poli(cloreto de vinilo) (PVC) plastificado, para construção de sensores (biomiméticos) seletivos a CEA, tendo-se avaliado a resposta analítica em diferentes meios. Obteve-se uma boa resposta potenciométrica em solução tampão de Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES), a pH 4,4, com uma membrana seletiva baseada em MIP preparada com o monómero carregado VB. O limite de deteção foi menor do que 42 pg/mL, observando-se um comportamento linear (versus o logaritmo da concentração) até 625 pg/mL, com um declive aniónico igual a -61,9 mV/década e r2>0,9974. O comportamento analítico dos sensores biomiméticos foi ainda avaliado em urina, tendo em vista a sua aplicação na análise de CEA em urina. Neste caso, o limite de deteção foi menor do que 38 pg/mL, para uma resposta linear até 625 pg/mL, com um declive de -38,4 mV/década e r2> 0,991. De uma forma geral, a aplicação experimental dos sensores biomiméticos evidenciou respostas exatas, sugerindo que os biossensores desenvolvidos prossigam estudos adicionais tendo em vista a sua aplicação em amostras de indivíduos doentes.

The proposed work concerns the development of a new plastic antibody (also known as Molecularly Imprinted Polymer, MIP) for carcinoembryonic antigen (CEA) and its application in the construction of portable, low-cost and small size potentiometric devices, to monitor this biomarker of colorectal cancer in point-of-care context. The plastic antibody was obtained by molecularly-oriented imprinting technology, making use of electropolymerization over a conductive glass surface (FTO glass). In brief, this was done by electropolymerizing aniline over the conductive glass and adsorbing CEA to this surface, surrounded or not by positively charged monomers (vinylbenzyltrimethylammonium chloride, VB). This was followed by subsequent electropolymerization of o-phenylenediamine (oPD) monomer, after which CEA was removed by proteolytic action of trypsin. The effectiveness of the imprinting process of CEA over the polymeric material was controlled by preparing a similar material, named non-imprinted polymer (NIP), where protein and VB were omitted. The obtained materials were chemically characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and confocal Raman spectroscopy. The obtained materials were used to prepare biomimetic sensors for CEA, by including these within plasticized poly(vinyl chloride) (PVC) selective membranes. The sensors were evaluated in different conditions (pH and composition). Good analytical performance was obtained under 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) buffer of pH 4.4, having selective membranes composed of MIP material with VB. The detection limit was <42 pg/mL, with a linear behaviour versus logarithm concentration up to 625 pg/mL, an average anionic slope of -61.9 mV/decade and a squared correlation coefficient >0.9974. The analytical behavior of the biomimetic sensors was evaluated in urine medium, because these devices were going to be applied in the determination of CEA in urine. Under this condition, the limit of detection was <38 pg/mL, for a linear behavior up to 625 μg/mL, an average slope of -38,4 mV/decade and a squared correlation coefficient >0.991. In general, the experimental application of the biomimetic sensors has produced accurate results, suggesting that the current biosensors could follow additional study to enable their practical application in real samples of diseased individuals.