Development of triplet repeat primed PCR (TP-PCR) technique as a support of molecular test in Machado-Joseph disease

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, 3 de Fevereiro de 2016, Universidade dos Açores.

[...]. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento e a validação de um protocolo de TPPCR para a DMJ. Sessenta e seis amostras de sangue previamente genotipadas por PCR foram utilizadas na otimização e validação da TP-PCR. A robustez da técnica foi testada em 14 amostras de esfregaço bucal de doentes heterozigóticos com um alelo expandido. Os resultados da TP-PCR foram concordantes com os obtidos pela PCR em 65 amostras de sangue. Os resultados obtidos para as amostras de esfregaço bucal foram 100% concordantes com os das amostras de sangue, demostrando que a técnica pode ser aplicada em diferentes tecidos e para uma baixa quantidade de DNA. A TP-PCR desenvolvida e validada para a DMJ deverá constituir uma técnica complementar fiável em laboratórios de diagnóstico, de modo a ultrapassar as limitações da PCR, relacionadas com a falha de amplificação dos alelos expandidos.

ABSTRACT: [...]. The purpose of this study was to develop and validate a TP-PCR protocol for MJD. Sixtysix blood samples previously genotyped by PCR were used to optimize and validate a TP-PCR assay. The robustness of the technique was evaluated using 14 buccal swab samples of heterozygous patients carrying an expanded allele. TP-PCR results were concordant with the ones obtained by PCR for 65 blood samples. The results obtained for the buccal swabs samples were fully concordant with the ones obtained for blood samples showing that the technique can be applied to different tissues and with low amounts of DNA. The TP-PCR developed and validated for MJD should constitute a reliable complementary technique in diagnostic laboratories to overcome the limitations of standard PCR related with the failure in amplification of the expanded alleles.