Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina D em géneros alimentícios: aplicação do método em diferentes matrizes alimentares

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

O objetivo deste trabalho foi o de realizar os ensaios de validação necessários à acreditação de um método analítico para determinação da vitamina D em matrizes alimentares. Após validação, o método foi aplicado a matrizes que incluíram papas infantis, iogurtes, cereais, leite, ovos e massas infantis. De forma a atingir este fim, foram otimizados procedimentos de tratamento das amostras e validado um método analítico baseado na norma europeia, EN 12821, o qual permitiu a determinação do teor em vitamina D através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pelo método do padrão interno. De forma a quantificar a vitamina D na matriz alimentar, as amostras sofreram um processo de saponificação seguido de extração líquido-líquido, e por fim isolamento e concentração através de cromatografia de HPLC semi preparativa em fase normal e, quantificação através de HPLC analítica em fase reversa a um comprimento de onda de 265 nm. De forma a validar o método de HPLC foram determinados os parâmetros de validação: precisão (repetibilidade e precisão intermédia), limite de deteção e de quantificação, recuperação e exatidão. Utilizando os resultados da validação, precisão intermédia e exatidão, foi determinada a incerteza do resultado da medição. A avaliação da incerteza total conduziu ao valor de 26%, para o nível de confiança de 95%. O teor em vitamina D nas amostras analisadas variou entre 0,28 μg/100 g e 22 μg/100 g. Os resultados da análise das amostras mostraram que 14% destas apresentavam valores superiores aos indicados nos respetivos rótulos e 43% valores inferiores aos rotulados. Tendo em considerações as porções definidas na rotulagem das amostras analisadas duas amostras ultrapassaram a dose diária recomendada (5 µg) se for consumida apenas uma porção (30 g). Os resultados obtidos permitiram concluir que o método validado é adequado para a determinação da vitamina D nas diversas matrizes analisadas.

Abstract: The objective of this study was to perform the required validation tests for accreditation of an analytical method for determination of vitamin D in food matrices. After validation, the method was applied to matrices that included infant porridge, yogurts, cereals, milk, eggs and infant pasta. In order to achieve this end, the procedures for processing samples were optimized and was validated an analytical method based on the European standard, EN 12821, which allowed the determination of vitamin D content using high performance liquid chromatography (HPLC) by the method of internal standard. In order to quantify the vitamin D in the food matrix, the samples were subjected to a process of saponification followed by liquid-liquid extraction and finally concentration and isolation by a normal phase HPLC semi-preparative and quantified by reverse phase HPLC analytical on a wavelength of 265 nm. In order to validate the HPLC method were determined the validation parameters: precision (repeatability and inter-run precision), limit of detection and quantification, recovery and accuracy. Using the results of the validation, inter-run precision and accuracy, the uncertainty of the measurement result was determined. The assessment of total uncertainty led to a value of 26% for the confidence level of 95%. The vitamin D content in the samples ranged from 0.28 µg/100 g and 22 µg/100 g. The results of the samples analysis showed that 14% of these were higher than the values indicated by the label and 43% lower than labeled values. Taking into consideration the portions size defined in the samples lable, two samples exceeded the recommended daily dose (5 µg) if consumed only a portion (30 g). The results showed that the validated method is suitable for the determination of vitamin D in different matrices analyzed.