Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters

Tese de Doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2015.

I acknowledge all the institutions and laboratories that have received me and/or provided logistic support and equipment to conduct the experiments. The departments of: Environmental Health, Genetics, Food and Nutrition, Infectious Diseases from the National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge.

The most common cyanotoxins in Portuguese freshwaters are microcystins and their occurrence has been mainly attributed to cyanobacteria from the Microcystis genus. However, most recently, it has been described the production of these toxins by species of the Planktothrix, suggesting that this genus is also a major producer of microcystin in Portuguese surface waters. Nevertheless, and conversely to the Microcystis species, the knowledge on the occurrence, distribution and toxigenesis of Planktothrix is still limited. Planktothrix species exhibits some particularities that difficult their sampling, identification, quantification and toxigenic characterization in natural samples - Chapter 2. Particularly, the morphology of Planktothrix colonies does not allow distinguishing easily the individual cells. This makes their identification and quantification by optical microscopy a very difficult task, although this is the method generally used in cyanobacteria monitoring. Moreover, the most common methods for the detection of microcystins (ELISA, HPLC) do not identify the producer strains. These strains can be identified by conventional PCR, but this method doesnt enable to quantify them. In resume, there is not yet available a method that allow simultaneously identify and quantify microcystin-producing strains. This work aimed to develop a method based on Real-Time PCR applied to the monitoring of toxic species of Planktothrix in surface freshwater reservoirs used as drinking water supply and for recreational activities. The experimental work was developed according to several phases that are listed and explained below. In a first approach, field surveys were conducted to access the occurrence and distribution of Planktothrix – Chapter 3. It was observed that Planktothrix has a wide distribution in Portuguese lakes and that Planktothrix agardhii is the most commonly found specie. Furthermore microcystin production was detected in isolates from this species. In a second stage, it was developed a method based on real-time PCR to detect and quantify Planktothrix agardhii - Chapter 4. The real-time PCR is a promising technique for cyanobacteria research and monitoring. The main advantage of real-time PCR over conventional PCR is the ability to quantify the target gene copy numbers on a sample. Thus, in addition to identifying Planktothrix strains, the real-time PCR also enables to quantify those strains, which constitutes an advantage over the procedures used in the routine monitoring of cyanobacteria. It should be noted that the determination of the cell FCUP Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters vii density is critical in the risk assessment of toxic cyanobacteria, as the guideline values for cyanotoxins are based on cyanobacterial concentrations as well as on toxin cell quota. Another important aspect in cyanobacteria monitoring is the use of preserved samples. Preservation is used to maintain the morphologic features of cyanobacterial cells to further be used in their identification/quantification and also to avoid sample degradation during transport. In this work, the applicability of the real-time technique in the amplification of DNA from preserved samples was evaluated, by using the method previously developed for cell quantification – Chapter 5. The results indicate that real-time PCR is a robust technique applicable to those types of samples but that the most common preservation methods (Lugol’s solution, formaldehyde, glutaraldehyde) reduce the DNA quantity and quality. Since DNA degrades fast in those samples, the applicability of real-time PCR on preserved samples was tested using other preservation procedure – Chapter 6. The preservation in methanol 100% at -20ºC allowed maintaining the integrity of the samples both for morphologic and molecular analysis up to two years after preservation. The last chapter of this thesis reports the result of two years of monitoring of a reservoir having a persistent bloom of toxic P. agardhii (Appendix A) - Chapter 7. In this reservoir, high cell densities did not always correspond to high amounts of toxin and vice versa. Using the real-time PCR it was demonstrated that both toxic and non-toxic strains are present within the reservoirs and that they can flourish at different times. It was also detected a specie from another genus that also contributes to the production of microcystins. During the monitoring it was observed a chytrid parasite that infected the filaments of Planktothrix (Appendix A). The density of this parasite was also quantified by real-time PCR and the results showed that its development coincides with the increase of toxic Planktotrhix strains and of microcystin levels in the reservoir.

Em Portugal, as cianotoxinas mais frequentes em águas doces são as microcistinas e a sua ocorrência tem sido sobretudo associada a cianobactérias do género Microcystis. No entanto, e mais recentemente, tem vindo a ser descrita a produção destas toxinas por espécies do género Planktothrix, sugerindo que este género é, também, um produtor importante de microcistinas nas águas doces superficiais portuguesas. Porém, e contrariamente às espécies Microcystis, o conhecimento acerca da ocorrência, distribuição e toxigénese de Planktothrix é ainda limitado. As espécies de Planktothrix apresentam algumas particularidades que dificultam a sua amostragem e identificação/quantificação em amostras naturais - Capítulo 2. Em particular, a morfologia das colónias de Planktothrix não permite distinguir facilmente as células individualizadas, o que torna a sua identificação e quantificação particularmente difíceis por microscopia óptica, o método geralmente usado na monitorização de cianobactérias no ambiente. Por outro lado, os métodos usados na detecção de microcistinas (ELISA, HPLC) não identificam as espécies produtoras. Estas estirpes podem ser identificadas por PCR convencional, mas este método não permite quantificar a sua densidade. Em suma, não está ainda disponível um método que, simultaneamente, identifique e quantifique as estirpes produtoras de microcistinas. Neste trabalho pretendeu-se desenvolver um método de PCR em tempo real aplicado à monitorização de espécies tóxicas de Planktothrix em reservatórios de água doce superficial destinados ao consumo humano e actividades balneares. O trabalho experimental desenvolveu-se de acordo com as fases que seguidamente se enumeram. Numa primeira fase realizaram-se estudos de campo de forma a avaliar a ocorrência e distribuição de Planktothrix em diversas albufeiras - Capítulo 3. Concluiu-se que o Planktothrix tem uma distribuição abrangente e que a espécie Planktothrix agardhii é a mais comum. Foi identificada a produção de microcistinas em isolados desta espécie. Numa segunda fase, foi desenvolvido um método de detecção e quantificação de Planktothrix agardhii, baseado na metodologia de PCR em tempo real - Capítulo 4. A metodologia de PCR em Tempo Real é bastante promissora para a investigação em cianobactérias, bem como para a sua monitorização no ambiente. A principal vantagem desta técnica, relativamente ao PCR convencional, é a possibilidade de quantificar o número de cópias do gene-alvo numa amostra. Assim, para além de identificar estirpes de Planktothrix, o PCR em tempo real é simultaneamente um método de quantificação, o que constitui uma vantagem relativamente aos procedimentos de rotina utilizados na monitorização de cianobactérias. De salientar que a determinação da densidade celular é fundamental na avaliação de risco de ocorrência de cianobactérias tóxicas, visto que os valores guia para as cianotoxinas se baseiam nas concentrações cianobacterianas e na quota de cianotoxina por célula. Outro aspecto importante na monitorização de cianobactérias é a utilização de amostras preservadas. A preservação é utilizada para manter as características morfológicas para posterior identificação e quantificação celulares e, também, para evitar a degradação do material biológico durante o transporte da amostra. Neste trabalho foi também avaliada a aplicabilidade do método de PCR em tempo real previamente desenvolvido, na amplificação de ADN de amostras preservadas - Capítulo 5. Os resultados indicam que o PCR em tempo real é uma técnica robusta e aplicável àquele tipo de amostras mas que os métodos mais comuns de preservação (Solução de Lugol, Formaldeído e Gluteraldeído) reduzem a quantidade/qualidade/disponibilidade de ADN. Como o ADN se degrada rapidamente após fixação das amostras, foi avaliada a aplicação do PCR em tempo real a amostras preservadas por outro método de preservação - Capítulo 6. A preservação em metanol 100% a -20ºC permitiu manter a integridade das amostras quer para análises morfológicas quer para análises moleculares até dois anos de preservação. O último capítulo desta tese reporta o resultado de dois anos de monitorização de uma albufeira que apresenta uma florescência persistente de P. agardhii tóxico (Anexo A) – Capítulo 7. Nesta albufeira, densidades celulares elevadas nem sempre correspondiam a quantidades elevadas de toxina e vice-versa. Utilizando a técnica de PCR em tempo real foi possível verificar que estão presentes estirpes tóxicas e não tóxicas e que podem florescer em alturas diferentes. Foi também detectado uma segunda espécie não pertencente ao género Planktothrix que poderá estar também a contribuir para a concentração de microcistinas. Durante a monitorização foi observado um parasita quitrídeo que infectava os filamentos de Planktothrix (Anexo A). A densidade deste parasita foi também quantificada através de PCR em tempo real e verificou-se que o seu aparecimento e desenvolvimento coincidia com o aumento de estirpes tóxicas e concentração de microcistinas.

Financial support provided for this research from the Foundation of Science and Technology through the project PPCDT/AMB/67075/2006 and PhD grant SFRH/BD65706/2009.