Deciphering the mechanisms underlying the loss of BDNF neuroprotection in an Alzheimer’s disease model

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016

O fator neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrophic factor - BDNF) desempenha importantes funções no sistema nervoso central, nomeadamente diferenciação e sobrevivência neuronais e regulação da transmissão e plasticidade sinápticas. Em algumas doenças neurodegenerativas, como na doença de Alzheimer (Alzheimer’s disease - AD) que se caracteriza por declínio cognitivo e perda de memória, sabe-se que a sinalização mediada pelo BDNF se encontra diminuída. De facto, tanto em doentes como em modelos animais de AD, existem evidências de que os níveis proteicos de BDNF e da isoforma completa do seu recetor, TrkB-FL (full length – FL), se encontram diminuídos. O BDNF tem também a capacidade de se ligar a recetores TrkB truncados (truncated TrkB – TrkB-TC), porém estes recetores são moduladores negativos de TrkB-FL, uma vez que são incapazes de iniciar as vias de sinalização mediadas pelo BDNF. Estudos recentes revelaram que o recetor TrkB-FL é clivado por um grupo de proteases, designadas por calpaínas, resultando na formação de um novo recetor TrkB truncado (TrkB-T’) e de um fragmento intracelular (intracellular domain - ICD) que é translocado para o núcleo. Não se conhecem ainda em profundidade as ações destes novos fragmentos mas sabe-se que a função do BDNF fica severamente comprometida. As calpaínas são proteases dependentes de cálcio, sendo por isso ativadas por um aumento dos níveis intracelulares deste catião. Os recetores N-metil-D-aspartato (NMDARs), importantes mediadores da plasticidade sináptica, são permeáveis a cálcio e podem ser encontrados tanto na região sináptica como na extrassináptica. Enquanto a ativação dos recetores NMDAR sinápticos resulta em alterações que promovem a neuroprotecção, a ativação dos NMDARs extrassinápticos induz, preferencialmente, fenómenos de morte neuronal. Curiosamente, sabe-se que os eNMDARs se encontram sobreactivados em diversas condições patológicas, inclusivamente em modelos de AD, e que podem ter um importante papel na desregulação dos níveis de cálcio intracelular. Assim, o trabalho desenvolvido nesta tese teve como objetivo investigar se a ativação dos eNMDARs contribui para a ativação das calpaínas e consequente clivagem dos recetores TrkB-FL, assim como a perda da sinalização do BDNF. Em primeiro lugar, investigou-se se a prevenção da ativação dos eNMDARs, em neurónios expostos ao péptido β amilóide (amyloid β – Aβ), inibia a clivagem dos recetores TrkB-FL pelas calpaínas. Para testar esta hipótese, culturas primárias de neurónios de rato Sprague-Dawley com 14 dias in vitro (DIV14), foram incubadas durante 24 h com Aβ25-35 (25 μM), o mais pequeno fragmento tóxico do péptido Aβ, e memantina (1 μM), fármaco que bloqueia preferencialmente eNMDARs sobreactivados. Os resultados obtidos indicaram, como esperado, que Aβ25-35 induz um aumento dos níveis dos produtos específicos da clivagem da αII-espectrina mediada pelas calpaínas (specific spectrin breakdown products – SBDP150) sugerindo que existe uma forte ativação destas proteases. Esta alteração traduziu-se na diminuição significativa dos níveis proteicos de TrkB-FL e num aumento nos níveis de TrkB-ICD. Por outro lado, os resultados mostraram, pela primeira vez, que os efeitos de Aβ25-35 são prevenidos pela co-incubação com a memantina: i) a formação de SBDP150 diminuiu, ii) os níveis dos recetores TrkB-FL aumentaram e iii) os níveis de TrkB-ICD diminuíram. Assim, os resultados indicam que a ativação dos eNMDAR parece estar envolvida na ativação das calpaínas e, consequentemente, na clivagem dos recetores TrkB-FL. Uma vez que a formação de novas sinapses são processos que estão na base da formação de memória, pensa-se que as alterações que decorrem no número de espinhas dendríticas num neurónio de um doente de AD tem um papel preponderante nos défices cognitivos que se desenvolvem possivelmente adjacentes à perda neuronal. Sabe-se que o BDNF aumenta o número de espinhas dendríticas, protusões sinápticas através das quais a maioria das sinapses excitatórias ocorre e que correspondem à força de atividade sináptica de um neurónio. Assim, propusemo-nos avaliar, através de imunocitoquímica, se a ativação dos eNMDARs está relacionada com a perda de espinhas dendríticas num neurónio. Os resultados foram obtidos a partir de neurónios provenientes da cultura primária de rato a DIV14. O número de protusões (espinhas dendríticas e filopodia, protusões mais finas) foi quantificado em frações de 10 μm da dentrite-mãe a uma distância de 25 μm do corpo celular do neurónio. Os resultados indicam, como esperado, que Aβ25-35 diminui significativamente o número de protusões e que o BDNF aumenta o número de protusões per se. Na presença de Aβ25-35, os resultados sugerem que o BDNF perde a sua ação no aumento do número de protusões. Essa função é recuperada aquando bloqueio dos eNMDARs com memantina, assim como bloqueio da atividade das calpaínas com MDL28170 (20 μM). Estes resultados propõem que os mecanismos através dos quais Aβ interfere com as espinhas dendríticas envolvem não só a ativação das calpaínas, como visto anteriormente, como também a ativação dos eNMDARs. Por outro lado, foi também nosso propósito avaliar se o bloqueio dos eNMDARs restaurava o efeito do BDNF na potenciação de longa duração (long-term potentiation – LTP) na área CA1 do hipocampo, o mecanismo fisiológico da aprendizagem e memória, cuja magnitude se encontra diminuída na presença de Aβ. Para tal, foram preparadas fatias de hipocampo de rato Wistar com 8-12 semanas de vida e após incubação durante 3h com Aβ25-35 (25 μM) e/ou memantina (1 μM) procedemos ao registo extracelular dos potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (field excitatory postsynaptic potentials – fEPSP) e à indução de LTP na ausência ou presença de BDNF (20 ng/mL). Os dados sugerem, como esperado que, em fatias incubadas exclusivamente com líquido cefalorraquidiano artificial (artificial cerebrospinal fluid - aCSF), o BDNF induz um aumento significativamente da magnitude da LTP e que, na presença de Aβ, o BDNF perde a sua ação na LTP. Curiosamente, os nossos resultados indicam, pela primeira vez, que a co-incubação de memantina e Aβ25–35 restaura a capacidade do BDNF em facilitar a LTP. Estes resultados indicam que a sinalização mediada pelo BDNF na LTP se encontra diminuída na presença de Aβ e que esta diminuição pode ser mediada pela ativação dos eNMDARs. Em conclusão, os resultados sugerem que, na presença de Aβ, a sinalização mediada pelo BDNF se encontra severamente diminuída, afetando as suas ações sinápticas, através de um mecanismo que possivelmente é mediado pela ativação dos eNMDARs. Estas evidências realçam a consequência funcional da clivagem dos recetores TrkB-FL induzida pelo Aβ e propõem a modulação dos eNMDARs de modo a prevenir a desregulação dos níveis intracelulares de cálcio e, consequentemente, a perda dos mecanismos neuroprotetores mediados pelo BDNF.

The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) plays important functions in the central nervous system, such as cell survival, neuronal outgrowth, differentiation and plasticity. In contrast, BDNF signaling is known to be impaired in some neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by cognitive decline and loss of memory. In fact, in AD patients and in several AD models a decrease in BDNF and its main receptor, TrkB-full length (TrkB-FL), has been reported. BDNF can also bind to truncated TrkB (TrkB-TC), however these receptors act as dominant negative inhibitor of TrkB-FL since they cannot initiate BDNF signaling. Recent evidences revealed that TrkB-FL is processed by calpains, which results in the formation of a new truncated TrkB (TrkB-T’) and in the formation of an intracellular domain (ICD) fragment. Thus, this cleavage culminates in the receptor loss of function. Calpains are Ca2+-dependent proteases that are activated by increased intracellular levels of this cation. N-methyl-d-aspartate receptors (NMDARs), which are known to be permeable to Ca2+, are essential mediators of brain synaptic plasticity and can be found at synaptic and extrasynaptic sites. Synaptic NMDARs are neuroprotective, whereas extrasynaptic NMDARs (eNMDARs) preferentially initiate cell death pathways. Importantly, eNMDARs are known to be over activated in AD. Furthermore, NMDARs have been proposed as one of the molecules that might be involved in intracellular Ca2+ deregulation. Thus, we purposed to investigate if, by preventing eNMDAR activation in primary rat neurons or hippocampal slices exposed to the active fragment of amyloid β (Aβ25-35) (25 μM), one of the main neurotoxic species that contribute to AD progression, we could inhibit the truncation of TrkB-FL by calpains, restoring the functions of BDNF. Our results have shown that the inhibition of eNMDAR by memantine (1 μM), which preferentially blocks extrasynaptic receptors over synaptic receptors, reduces significantly the activation of calpains. These findings are related with an increase in TrkB-FL levels and a decrease in ICD levels. Moreover, it is known that BDNF increases the number of spines in one neuron, which are synaptic protrusions where the majority of excitatory post-synaptic domains are localized and that can highly predict the strength of synaptic activity. Our results indicate that, in the presence of Aβ, BDNF loses its function upon spine density, which is prevented when calpains activity is inhibited with MDL28170 (20 μM) or while eNMDAR blockade. Finally, data suggest that the inhibition of eNMDAR restores the capacity of BDNF to enhance long-term potentiation in hippocampal slices, the physiological basis for learning and memory that is known to be impaired in the presence of Aβ. Finally, the focus of our work was to clarify the mechanism by which BDNF loss its function upon synapses. In conclusion, data suggest that, in primary neuronal cultures and hippocampal slices, Aβ severely impairs BDNF/TrkB-FL signaling affecting the synaptic actions of BDNF by a mechanism that is, at least in part, mediated by eNMDARs activation. These findings highlight the functional consequence of the Aβ-induced cleavage of TrkB receptors and propose eNMDAR modulation to prevent the disruption of Ca2+ homeostasis and, consequently, the loss of physiological mechanisms that depend on BDNF.